贵州桐梓天花粉rDNA ITS序列分析

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【摘 要】目的：对贵州桐梓天花粉rdna its序列（包括ITS1、5.8S和ITS2）进行序列测定与分析，为其基源鉴定和品质评价提供分子依据。方法：采取改良CTAB法提取天花粉总DNA，PCR扩增ITS序列后直接测序，在GeneBank中将测序结果进行同源搜索，再将同源序列用MEGA5.1软件进行变异位点分析、遗传距离测定及同属植物ITS序列系统发育树的构建。结果：贵州桐梓天花粉ITS序列与GeneBank中三组同源序列存在变异位点107个、遗传距离范围在0.0252到0.0597之间、物种间亲缘存在较明显的远近关系。结论：ITS序列可以有效地鉴别贵州桐梓天花粉，ITS序列分析技术对近缘种类群间系统学研究及品种鉴定具有较大的意义，同时为进一步利用分子生物学技术鉴定中药材奠定了基础。

【关键词】天花粉 rDNA ITS序列 药材

天花粉来源为葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥根，亦称瓜蒌根、栝楼根。栝楼为多年生草质藤本，又名瓜蒌、大圆瓜、鸟瓜、吊瓜。栝楼喜温暖潮湿气候，较耐寒，不耐干旱，生于山坡、草丛、林缘半阴处。栝楼以家种为主，主产于贵州桐梓、河南安阳、山东济南、湖北荆州等地[1]。栝楼属Trichosanthes L.植物全世界有84种8变种，中国有37种6变种，本属有多种药用植物，药典2005年版收载了2种，《中药志》收载了7种，例如栝楼T.kirilowii Maxim，其果实（瓜萎）、根（天花粉）都是常用中药。从栝楼根中提取的天花粉蛋白（trichosanthin）是中期妊娠引产的有效蛋白质，同时其亦具有抗葡萄胎活性及抗艾滋病（AIDS）的活性。调查发现各地所用天花粉来源复杂，不同植物来源的天花粉，其疗效也不完全一致，某些混淆品如湖北括楼、木鳌子根等还有一定的不良反应[2，3]。准确鉴别植物基源是正确开发利用和用药安全有效的基础，已有随机扩增多态性DNA分子技术以及蛋白测植物的核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）是由串联重复排列的单位组成，每个单位基因组等方法对天花粉及其混淆品进行鉴别的探索[4，5]。序列从5’到3’依次为：外部转录间隔区（ETS）、18S rDNA、内部转录间隔区1（internal transcribed spacer，ITS1）、5.8S rDNA、内部转录间隔区2（ITS2）、28S rDNA和基因间隔序列（IGS）。其中ITS序列是中度保守区，进化速率较快，既具有核苷酸序列高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上（如属间、种间）解决植物系统发育问题，因此被广泛用于近缘属间、属内以及种内居群间的差异性研究[5-7]。ITS1、ITS2分别位于18S～5.8S rDNA、5.8S～26S rDNA之间，而18S rDNA、5.8S rDNA、26S rDNA的序列又非常保守，这样就可以用与它们序列互补的通用引物对ITS序列进行PCR扩增、测序。但是ITS1、ITS2序列的核苷酸序列变化较大，可以提供丰富的系统学信息[8，9]。近年来，rDNA ITS序列应用于中药材的鉴别也有较多报道[7]，关于天花粉的研究，前人主要集中于对同属间物种的显微和理化鉴定，而根据rDNA ITS序列鉴别天花粉则尚未见报道[10-12]。本文拟对天花粉的rDNA ITS序列进行PCR、测序和序列分析，并建立天花粉rDNA ITS数据库。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验样品

天花粉实验材料样品于2011年12月采自于贵州桐梓，样品号：KT030301，登录号：KC733407，所用标本由牛宪立老师提供。

1.1.2 主要实验试剂

（1）70%乙醇：量取70ml的无水乙醇，30ml双蒸水，混匀。（2）0.5mol/L EDTA（pH=8.0）：称取EDTA-2Na-2H2O 18.7g，加入双蒸水75ml，用NaOH调pH至8.0，加双蒸水定容至100ml。（3）0.5mol/L Tris-HCl（pH=8.0）：称取Tris 30.28g，加入双蒸水350ml，用HCl调pH至8.0，再加双蒸水定容至500ml。（4）3mol/L NaAc溶液：称取无水乙酸钠24.608g，先加入双蒸水80ml加热溶解，再加双蒸水定容至100ml，121℃灭菌15min，4℃保存。（5）CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液：称取CTAB 10g，加70ml双蒸水溶解，再取0.5mol/L Tris-HCl（pH：8.0）40ml，0.5mol/L EDTA（pH：8.0）8ml，5mol/L NaCl 56ml，加双蒸水定容至200ml，室温保存，使用前先加入0.2%β-巯基乙醇。（6）氯仿：异戊醇（24：1）：量取192ml氯仿，8ml异戊醇，混匀。（7）TE液：量取0.5mol/L Tris-HCl（pH：8.0）4ml，0.5mol/L（pH：8.0）EDTA（乙二胺四乙酸）0.4ml，加双蒸水定容至200ml，分装至3个干净小瓶中，121℃灭菌15min，4℃保存。（8）5xTBE溶液：称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）16.2g，硼酸8.25g，0.5mol/L EDTA（pH：8.0）6ml，加双蒸水至300ml，室温下保存，临用时稀释10倍。（9）苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）：分别量取苯酚、氯仿：异戊醇（24：1）各100ml，再混匀。（10）随机引物、Taq DNA聚合酶、β-巯基乙醇、dNTP、MgCL2。

1.1.3 实验仪器

HH-W21.C600电热恒温水温箱（北京长源实验设备厂）；10R型冷冻高速离心机（Eppendorf）；FH-202B紫外透射分析仪（上海精科实业有限公司）；ema-8000型PCR仪（珠海黑马仪器厂）；岛津UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）DYC型电泳仪（北京六一仪厂）。

1.2 方法与步骤

1.2.1 DNA提取（改良CTAB法）

（1）称取天花粉200mg，剪成小碎片放置于冷研钵中，用液氮迅速研成糊状或粉状，将糊状或粉状物转入至预冷的1.5ml干净离心管中，加入600?l预热的DNA提取缓冲液，充分摇匀，65℃水浴1h，在水浴过程中每10min温和颠倒混匀1次。（2）取出离心管，使之恢复室温，加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）抽提，轻缓颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min。（3）取上清转移至另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）轻轻颠倒混匀后9000rpm离心15min。（4）吸取上清液，加入1/10体积的10% CTAB溶液（10% CTAB，0.7mol/L NaCl），再加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）重复抽提1次，重复氯仿-异戊醇抽提，轻缓颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min。（5）上清加入2/3倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置30min后，4000rpm，离心10min，弃去上清液。用70%乙醇和无水乙醇洗涤沉淀各洗1次，室温吹干后溶于200?l TE。（6）当沉淀无乙醇味时，将DNA溶于300?l TE，加入5?l RNA酶，37℃恒温水浴箱保温1h。（7）上清液移入新的离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaCl（pH=5.2）溶液，混匀后加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置50min，DNA形成絮状沉淀。8）钩出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗，分别加入70%和90%乙醇去除残留的无机离子，在室温下自然风干直至沉淀无乙醇味，视沉淀的多少而溶入适量的TE缓冲液，分装后放入-20℃储存或放入4℃待用。

1.2.2 DNA纯度及片段大小的检测

（1）纯度检测：将DNA样品稀释200倍后，在UV-2550紫外分光光度计上测定其在260nm、280nm处吸光度值，根据OD260、OD260/OD280值来判断DNA的浓度和纯度。[附：DNA浓度计算公式：DNA浓度（ug/ml）=OD260×稀释倍数×50]。（2）电泳检测：运用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，检测样品DN段的大小，观察并且拍照。

1.2.3 电泳-琼脂糖凝胶板配制方法

（1）制备1.0%的琼脂糖凝胶（50ml）：称取0.5g琼脂糖于干净锥形瓶中，再加入50ml的0.5×TBE。酒精灯加热煮沸至琼脂糖全部融化，即得1.0%琼脂糖凝胶液。（2）取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净并晾干，取胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。（3）将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入0.5?L的核酸染色剂Goldview，轻轻混匀。小心地倒入有机玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。（4）室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加0.5×TBE电泳缓冲液至没过胶板为止。（5）取1?L上样缓冲液与DNA样品混合。用10?l微量移液器分别将Marker和样品加入胶板的样品槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（6）加样后的凝胶板立即通电进行电泳，正确连接电泳槽和电源，黑线连阴极，红线连阳极，电压80V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。（7）在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

1.2.4 ITS扩增和测序

（1）参考white等设计一对通用引物，用于扩增ITS1、5.8S、ITS2完整序列，P1（5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3’）位于18S上，P2（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）位于26S上，由上海生工生物工程技术有限公司合成。（2）采用P1和P2双引物整段扩增，在50L反应体系中，内含基因组DNA（1L）、引物各（1L）、DNA聚合酶2.5U、dNTP（0.1mmol/L）、MgCl2（1.5mmol/L）。反应条件：PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性2min，52℃退火3min；72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。（3）反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，分别送上海生工和上海英骏广州分公司做双向测序。

1.2.5 序列分析

经公司测序的结果进行手工校正，采用MEGA5.1软件对4组rDNA序列进行比对分析，遗传距离测定，并用MEGA5.1软件绘制NJ（最大似然法）系统树。

2 结果

2.1 DNA的浓度

200mg贵州桐梓天花粉样品经改良CTAB法提取DNA后，采用紫外分光光度计测得总DNA量为520?g/ml，OD260/OD280值为1.822。

2.2 PCR扩增

天花粉样品经改良CTAB法提取总DNA，PCR扩增所用Maker大小分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp，扩增后得到了产物（见图1），条带清晰、无非特异条带、无拖尾现象，表明扩增结果很好，可用于测序。提取的贵州天花粉总DNA经PCR扩增之后得rDN段大小为2000bp，rDNA ITS序列的长度都在500bp到750bp之间。

图1 ITS序列PCR扩增产物电泳图谱

M：DNA标准参照物（DL2000）；1为样品ITS；2为样品总rDNA

2.3 测序结果及序列分析

经测序得到贵州桐梓天花粉rDNA ITS序列，根据近源种天花粉基因库中已确定的5.8S、28S序列与标本序列进行对比分析，确定rDNA ITS1和ITS2与18S、5.8S、26S的界限，并建立标本登录号为KC733407。由Blast软件搜索天花粉标本rDNA ITS序列同源的三组序列，登录号分别为FJ980304、GU059533、HE661360。四组序列序号分别为下图表中（1）、（2）、（3）、（4），经MEGA5.1软件进行序列对比分析后结果是ITS区序列存在107个变异位点，占总位点15.1%，具体变异位点见表1；遗传距离在0.0252到0.0597之间（表2）；由MEGA5.1软件构建邻接树所得到的系统发育树（图2）中，标本天花粉与GeneBank中登录号为GU059533物种聚在一起，表明二者有较近的亲缘关系，而与其他两种同源物种亲缘关系相对较远。

表1 天花粉序列对比

表2 遗传距离分析

图2 NJ树物种鉴定

结合表1、表2、图2可判断出贵州桐梓天花粉的rDNA ITS区序列与GeneBank中已确立同属物种的ITS序列有一定程度的差异，即贵州桐梓天花粉rDNA ITS序列具有特异性，这种特异性为贵州桐梓天花粉的基源鉴别提供了分子基础。

3 讨论

人们在对植物的不断探索与开发利用的过程中发现了药用植物即中药，中药对于疾病的预防治疗起着非常重要的作用，虽然人类对中药的使用已有上千年的历史，但由于大多数药用植物一般都来源广泛，且不同来源的同种药用植物其疗效也存在一定的差异，甚至药效完全相反，因此，建立完善的药用植物鉴别体系是人类安全用药的前提和基础。随着遗传学知识的不断挖掘和丰富以及植物大部分次生代谢产物分离方法的完善与结果鉴定技术的改进，进一步强化了人们对药用植物的正确认识和研究；近代分子学方面的不断突破，使以形态组织学、解剖学等客观指标为划分依据的传统分类学得到了补充，为药用植物系统与进化研究提供了可靠丰富的资料，为解决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面提供了极为有力的技术途径。目前，许多研究者将DNA ITS区的特异性应用于药用植物的鉴别，为探索药用植物的遗传差异和鉴定中药材品种的基源问题提供了新的技术和方法。

DNA ITS区序列具有多种优点，例如：进化速率快让不同来源的同种药用植物具备遗传特异性；基因片段短、直观性强、重现性好都使得PCR扩增和测序简便高效。本实验中为了得到准确的ITS序列信息，采用了高保真DNA聚合酶，不同批次的PCR产物分别送交两个公司（上海生工和广州英骏）进行双向测序，测序结果基本一致。

获取高质量的DNA是分子生物学研究的基础。本实验在基因组DNA的提取中，加入液氮研磨，使植物细胞壁破裂。CTAB提取液中的CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入NaAc和乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中；Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性防止DNA降解；NaCl提供一个高盐环境；β-巯基乙醇是抗氧化剂，能有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA。因为酚能使蛋白变性，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。酚的变性抽提作用要比氯仿好，但酚和水有一定比例的互溶；氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，但其和水基本上没有互溶，而酚又溶于氯仿中，所以综合二者的效果，先用酚抽，再用氯仿抽，既能保证蛋白的抽提效果，又能去除核酸溶液中的少量酚。而异戊醇不仅能减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，降低表面张力，从而减少气泡产生。而且，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。在沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀，加入乙醇可以除去盐离子。加入RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

通过对不同产区天花粉序列的比对分析、遗传距离的测定、物种亲缘鉴定，发现天花粉的来源不同其基因序列也有所差异，特别是rDNA ITS区序列存在明显的差异，这为本研究的可行性提供了确切的依据。在对实验方法的探索中，我们预先采用RAPD技术对不同产区的天花粉进行鉴定，但结果显示不同产区的天花粉均扩增出相同的条带，无法实现本研究的实验目的，这很大程度是由于RAPD技术本身存在重复性差且易受药材产地和储存时间影响的局限性，故利用RAPD技术来分类和鉴定药用植物的依据不完全可靠确切，而采用rDNA ITS区序列分析技术可完全避免RAPD技术的不足，本研究就完全证明ITS序列分析能够正确鉴定天花粉的基源。

4 结语

ITS序列可以有效地鉴别贵州桐梓天花粉，ITS序列分析技术对近缘种类群间系统学研究及品种鉴定具有较大的意义，同时为进一步利用分子生物学技术鉴定中药材奠定了基础。

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作者简介：沙伟桥（1992―），男，遵义医学院生物工程专业本科生，研究方向：生物化学与分子生物学。

*通讯作者：许朋（1993―），男，遵义医学院生物工程专业本科生，研究方向：生物化学与分子生物学，已主持院级科研课题两项，参加省级课题一项，多篇。