拟南芥AtMGT3基因转运功能研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇拟南芥AtMGT3基因转运功能研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘 要：对拟南芥atmgt3基因的Mg2+转运功能进行了初步研究，AtMGT3转录本的半定量分析表明，AtMGT3在根、茎、叶、花、角果中均有表达，但在花中表达量最高，根中最少，MM281功能互补和液体生长曲线结果表明：AtMGT3功能互补细菌Mg2+转运突变株，具有Mg2+转运能力；AtMGT3介导Mg2+的低亲和性吸收，是一个低亲和性Mg2+转运蛋白；AtMGT3可能还能转运Fe2+，但转运Fe2+浓度超出了正常的生理浓度，在正常生理条件下，At-MGT3的主要生理功能是作为Mg2+转运蛋白起作用。
关键词：AtMCT3；功能互补分析；低亲和Mg2+转运蛋白
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)04-0328-06
Mg2+是植物细胞中最丰富的二价金属离子，其在一系列酶促反应中作为辅因子起作用，Mg2+是构成叶绿素的主要组成成分和酶的活化剂，参与脂肪代谢，促进磷素的转运以及某些维生素的合成；并且参与维持细胞膜的稳定；Mg2+对植物液泡离子通道以及叶绿体RNA的稳定性都有重要的调控作用，缺失足够的Mg2+，核糖体亚单位将会分离，同时细胞膜也会变成松弛渗漏的状态，离子状态的镁调节许多重要的酶促代谢，还可通过特定的金属结合位点在膜蛋白通道中起作用。
由于Mg2+独特的几何特性和化学特性，有人猜测其转运系统也具独特性，细菌中的研究支持该假说，目前，整个生物界中已发现有五大Mg2+转运家族：CorA家族、Mg2+/H+交换体、离子通道、P型磷酸酶和MgtE基因家族，主要的Mg2+转运家族是细菌中的CorA家族，CorA序列上存在保守基序GMN，是其转运Mg2+所必需的，若GMN基序中有一个氨基酸突变，其转运能力就会丧失，ALRl和ALR2是在酵母中发现的一类CorA基因，在酵母中过量表达ALR蛋白可提高其对铝毒害的抗性，MgtA/B是5，typAimurium中发现的另外两个具Mg2+转运能力的基因，两个都是大的复合跨膜蛋白，属于P型磷酸酶家族，它们的表达受到低浓度Mg2+的诱导。
到目前为止，在高等植物中鉴定出两类具Mg2+转运活性的转运蛋白：一类是Mg2+/H+交换体，它是一类质子依赖性转运蛋白；另一类是CorA-like镁离子转运蛋白。
1999年Shaul在模式植物拟南芥中克隆到一个在液泡膜上编码转运蛋白的基因AtMHX，AtMHX是第一个从多细胞有机体中克隆到的Mg2+转运蛋白，也是在植物中首个被发现的Mg2+/H+交换蛋白。其作为一种Mg2+(Zn2+)/H+交换蛋白发挥作用Ls，Northern杂交分析显示，AtMHX mRNA在拟南芥的各个组织中均有表达。
CorA家族是五大Mg2+转运基因家族最大的一个，其广泛存在于细菌、真菌、酵母、哺乳动物和高等植物中，其蛋白具有独特的拓扑结构，2002年Li等在拟南芥中鉴定出一个与细菌CorA同源、蛋白结构相类的AtMGT家族，此家族有10个成员，成员的氨基酸序列多样，氨基酸的同源性范围从15％～89％，在家族的系统发育中，AtMGTl和AtMG72，AtMGT5和AtMGT6，AtMGT7、tMGT8和AtMGT9各自成簇，亲缘关系较近，而且tMGTIO在系统发育中另外分支，与其它成员亲缘关系较远。
目前AtMGT基因家族已有的研究表明，AtMGT家族存在两种Mg2+转运蛋白：高亲和性Mg2+转运蛋白和低亲和性Mg22+转运蛋白。高亲和性Mg2+2+的转运是在低浓度范围内进行的，其主要依靠转运体来完成，拟南芥AtMGT家族中的AtMGT1、AtMGT2和AtMGT10这3个蛋白的氨基酸序列上都含有2个疏水的跨膜区，并且第2个跨膜区上都有保守基序GMN，已鉴定属于高亲和性Mg2+转运蛋白，AtMGTl功能互补细菌Mg2+转运突变体，不仅能转运Mg2+，还能转运别的二价阳离子如：Fe2+、Mn2+、Cu2+、CO2+等，但转运这些阳离子的浓度都超出了植物正常生长的生理浓度，因此该基因的功能主要是进行Mg2+转运，AtMGT2参与呼吸作用，AtMGT10功能互补酵母M广转运突变体，定位于质膜上，低亲和性Mg2+转运是在外界Mg2+浓度为m mol/L级进行转运，且在生理浓度范围内不会达到饱和，已从AtMGT家族中鉴定出第一个低亲和性Mg2+转运蛋白-AtMGT7，通过MM281功能互补发现AtMGT7转运Mg2+的能力受到pH值的影响，本研究的对象AtMGT3亦属于低亲和性Mg2+转运蛋白，
多个转运蛋白基因与Mg2+转运有关，它们可能在植物细胞不同的膜上起作用，除了质膜外，细胞中还有很多其它细胞器膜，如线粒体膜、叶绿体膜、液泡膜、高尔基体膜等，已知AtMGT1、AtMGT7和AtMGT10定位在质膜上，AtMGT2定位在线粒体内膜上，AtMHX在液泡膜上介导Mg2+的转运；其它的Mg2+转运蛋白也有可能在其它细胞器膜上发挥作用，然而，即使某些基因定位在相同的膜上，它们也可能在植物的不同组织中，或者相同组织的不同发育时期起到Mg2+专运功能，
本研究以AtMGT3基因为研究对象，目的在于鉴定AtMG73蛋白的转运特性，进而分析AtMGT3的蛋白结构与转运以及转运亲和性的高低之间的关系，探讨AtMGT3在植物的生长发育过程中的生理功能，为进一步的揭示Mg2+转运机
制打下基础，以上还只是Mg2+转运机制的初步研究，Mg2+转运基因家族的转运机制，以及在植物体内的生物学功能，尚需更进一步的研究。
1 材料和方法
1．1 菌株的生长条件
E.coli DH5a在37℃，LB培养基中生长，并添加相应抗生素，S.typhimurium MM281需要高浓度Mg2+才可以生长，它被用于功能互补实验，于37℃，Mg2+(以MgS04的形式添加)终浓度为100mmol/L，氯霉素浓度为34mg/L的LB或N-minimal培养基中生长。
1．2 载体、酶类及各种试剂盒
pMDl8-T载体和实验中用到的所有酶类均购自大连宝生物工程有限公司，质粒纯化及胶回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术公司，pTrc-99A由本室保存。
1．3 AtMGT3基因的克隆及载体构建
拟南芥基因组DNA按照Robert K FlamnC的方法提取，根据AtMGT3基因序列利用PrimerPremier 5.0软件设计一对引物，正向引物序列为5′-TYGGACTCCTYCTGTYI'CACTGG-3′，反向引物序列为5′-AAGCCTAAGCTCAGCA AAAGACA-3′，用高保真酶Pyrobest DNA Polymerase进行PCR扩增，回收目的片段，连接到pMDl8-T载体上，再用EcoR I和j(pn I酶切，定向克隆至表达载体pTrc99A，并酶切鉴定阳性克隆。
1．4 生物信息学分析的主要软件及数据库
基因序列数据由NCBI中获得，跨膜区分析软件为TMHMM，多序列比对软件为ClustalW，常规的核酸蛋白分析软件利用DNAMAN进行。
1．5 表达模式分析
根据Ambiogen公司的RNA提取方法提取各个组织的总RNA：根、茎、叶、花、果；取相同量的不同组织的RNA，用eDNA合成试剂盒M-MLVReverse Transcriptase(Invitrogen公司)合成cDNA，应用软件Primer Premier 5.0设计特异的表达模式引物：正向引物序列为5′-CCTrGACCCTITGTI'TATCTATC-3′，反向引物序列为5′-CTCAGTCAAATACATCTCAGCC-3′，PCR扩增：以β-Actin作为内参，以不同组织的总eDNA作为模板进行PCR扩增，最后进行琼脂糖电泳检测。
1．6 MM281功能互补实验
挑取MM281，MM281-pTrc99A，MM281-PTrC99A-AtMGTl0，MM281，pTrc99A-AtMGT3的单菌落在试管中过夜培养，然后再按50:1(50mLLB:1 mL菌液)的比例接种于含有相应抗生素的锥形瓶中扩大培养。
测菌OD600，当达到0.6～0.7时加入1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导至OD600达到1.0时取出转化的菌液100μL，以10的倍数稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-4mmol/L 5个浓度梯度，将稀释的菌液各取2μL点样于互补N-Minimal固体培养基上，37℃倒置培养2d，观察菌落生长情况。
1．7 液体生长曲线
挑取MM281，MM281-pTrc99A-AtMGTl0，MM281-pTrc99A-AtMGT3的单菌落在含相应抗生素的LB中摇菌，摇至OD600=0.6～0.8时，5000g离心收获细胞，用去离子水清洗两遍，以除去残留的Mg2+，然后悬浮在去离子水中，准备4种不同Mg2+浓度(100μmol/L，500μmol/L，2mmol/L，10mmol/L)和相应抗生素的N-minimal培养基，将上述准备好的培养物(起始OD600=0.001～0.002)加入N-Minimal培养基，37℃菌，24h测OD 600监测生长情况。
1．8 阳离子敏感性实验
配制pH 7.0含0.1mol/L Mg2+的不同二价离子N-Minimal固体培养基，这些二价阳离子包含Cd2+、CO2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+，每种离子分别配制了一系列的浓度梯度(0、10、100μmol/L，1、10mmol/L)。
按功能互补实验过程一样准备好菌液，然后点至不同浓度的金属离子板上，37℃倒置培养1d后观察其生长情况并拍照。
2 结果与分析
2．1 AtMGT3的cDNA序列的结构分析
用从拟南芥基因研究中心(ACI)得到的基因信息，设计特异性引物，通过RT-PCR来扩增AtMGT3基因的预测编码区，通过测序分析，所得到AtMGl3的开放阅读框含有1266 bp的核苷，编码421AA的蛋白，其序列与AGI中心预测的序列一致，与AtMGT1相比，AtMGT3的C端序列有两个跨膜区，第1个跨膜区是Leu337和Asn379之间，第2个跨膜区是Phe391和Phe413之间，AtMGT3拥有完整的转运镁离子的结构(图1 A，B)。
2．2 AtMGT3的表达模式
以β-Actin作为内参，对AtMGl3进行表达模式分析，通过平台期摸索，确定了Actin基因在32个循环时达到平台期；而AtMGT3基因在35个循环时达到平台期，因此，在表达模式分析中，Actin引物进行29个循环的扩增，AtMGT3引物进行32个循环的扩增，由图2可以看出，AtMGl3在根、茎、叶、花、果中都有表达，其中，在花中的表达量最高，而在根中的表达量最低。
2．3 AtMGT3可功能互补MM281的生长
MM281是一类丧失了CorA，MgtA，MgtB Mg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株，它只能在高浓度Mg2+(＞100mmol/L)下达到最佳生长速度，结合功能互补的方法，它可作为一个研究Mg2+转运的很好的系统，表达了AtMGT3的MM281重组菌株可在低浓度Mg2+情况下生长，而其阴性对照MM281，
MM281-pTrc99A则只能在大于10mmol/L的N；minimal培养基上生长(见图3)，互补结果可以说明AtMGT3的表达互补了MM281在Mg2+转运上的功能缺失，使之重新具有了Mg2+转运能力，从而使其可在含低浓度(＜10mmol/L)M广的培养基中生长，然而， 阳性对照MM281-pTrc99A-AtMGTl0能生长在低至100μmol/L Mg2+的培养基上，与高亲和性的镁离子转运蛋白AtMGT10相比，AtMGT3的转运能力明显低于AtMGt10。
MM281，MM281-pTre99A-AtMGTl0和MM281-pTre99A-AtMGT3 3种菌液生长在含100、500μmol/L，2、10 mmol/L Mg2+(含相应抗生素)的N-Minimal培养基上，24h内连续测OD600值进行监测，由图4可知，表达了目的基因的MM281转化子可在2mmol/L的N-minimal培养基中生长，而阴性对照只能在10mmol/L的培养基中生长。生长曲线结果与MM281功能互补结果基本一致，也再次证明了目的基因的转运能力，但转运功能明显低于AtMGT10。
2．4 AtMGT3的表达改变了MM281对二价铁离子的敏感性
已有研究显示，当细菌中积累一定量的重金属离子(如CO2+，Cd2+，Mn2+，Zn2~2+)时，就会对细菌本身产生毒害作用并使之死亡，由图5可知，表达了AtMGT3基因的转化子增加了对Fe2+的敏感性，当Fe2+离子浓度达到5mmol/L时，表达了目的基因的菌株就会死亡，我们可以认为AtMGT3有Fe2+离子的转运能力，我们也进行了Co2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+的离子敏感性实验，但没有发差别(数据未显示)，然而，转运Fe2~的浓度较高，达到了5mmol/L，在自然条件下极其罕见，因此我们推测，AtMGT3主要还是行使Mg2+转运功能。
3 讨论与分析
植物细胞内各种离子(包括Mg2+)和营养物都必须达到良性动态平衡，以此保证细胞内环境的稳定，Mg2+在植物的生长发育中起着重要的作用，对维持植物体内的离子动态平衡具有重要作用，植物必须在整体水平和细胞水平上严格控制镁离子的转运，以适应土壤中不断变化的镁离子含量及应付其它形式的胁迫。
拟南芥AtMG了家族10个成员中已有4个成员AtMGTl、AtMGT2、AtMGT7、AtMGTl0被鉴定具Mg2+转运功能，其中AtMGT1、AtMGT2、AtMGT10为高亲和性镁离子转运蛋白基因，AtMGT7是鉴定出的第1个低亲性的镁离子转运蛋白基因，AtMGT3是鉴定出来的另一个低亲和性的镁离子转运蛋白基因。
本研究通过表达模式分析表明：AtMG73在拟南芥中主要在花中表达，在茎、叶、角果中也有表达，而在根中的表达量最少，生化研究表明：AtMG73具有镁离子及其他阳离子转运能力，AtMGT3功能互补细菌Mg2+转运突变株，具有Mg2+转运功能，但对Mg2~的亲和性较低，是一个低亲和性M广转运蛋白，AtMGT3还能转运别的阳离子，如Fe2+，但是转运Fe2+离子的浓度较高，在自然条件下罕见，因此可以推测，在生理条件下AtMGT3主要选择Mg2+，是一个Mg2+转运蛋白。
植物中为什么会存在高亲和与低亲和两种不同机制的Mg2+专运蛋白?这可能有以下几个原因：
1)植物根系对Mg2+的吸收转运可能存在两种机制：高亲和Mg2+吸收(uizh affinity Mg2+uptake)与低亲和Mg2+吸收(Low-affinity Mg2+uptake)，高亲和Mg2+转运蛋白可能在外界Mg2+浓度低时(为μmol/L范围内)发挥作用。低亲和Mg2+转运可能在外界Mg2+浓度高时(在mmol/L水平)发挥作用，为了适应土壤中不断变化的镁离子含量及应付其它形式的胁迫，就需要有不同特性的Mg2+转运蛋白来介导植物根部对Mg2+的吸收。
2)在细胞本身的内环境中，不同的亚细胞环境中Mg2+的浓度也不一致，多个转运蛋白基因与Mg2+转运有关，它们可能在植物细胞不同的膜上起作用，除了质膜外，细胞中还有很多其它细胞器膜，如线粒体膜、叶绿体膜、液泡膜、高尔基体膜等，已知AtMGT1、AtMGT7和AtMGT10定位在质膜上，AtMGT2定位在线粒体内膜上，AtMHX在液泡膜上介导M广的转运；其它的Mg2+转运蛋白也有可能在其它细胞器膜上发挥作用，然而，即使某些基因定位在相同的膜上，它们也可能在植物的不同组织中，或者相同组织的不同发育时期起到Mg2+转运功能，因此在植物的不同发育时期以及不同的亚细胞结构之间需要有不同转运特性的Mg2+转运蛋白来介导Mg2+的转运，维持植物细胞中Mg2~的动态平衡。
综上所述，我们对Mg2+转运基因AtMGT3进行了生化功能的初步研究，进一步的研究可集中于AtMGT3转运Mg2+的直接证据，如原子吸收分光光度实验，同位素示踪实验，及其转运Mg2+是否是离子偶联的，又与何种离子偶联，从而为更好地理解AtMGT家族转运Mg2+的分子机制提供新的信息。
作者简介：邓沛怡(1982―)，男，湖南怀化人，硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究；李东屏(1966―)，男，湖南安乡人，湖南师范大学副教授，博士，通讯作者，主要从事植物分子生物学研究。