双黄复方对SMC及CCC-ESF细胞增殖的影响
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[摘要] 目的：探讨双黄复方（SHMC）对兔主动脉平滑肌细胞（SMC）和人胚胎成纤维细胞（CCC-ESF）的促增殖作用。方法：采用MTT法测定不同浓度、不同时间SHMC对SMC和CCC-ESF的促增殖作用，并以流式细胞术检测SHMC对其细胞周期的影响。结果：与空白对照组比较，SHMC作用后，各组OD490显著增高，G2/M期细胞比例明显增加，但SMC的增殖与剂量无明显相关。双黄复方大剂量短时间内作用于CCC-ESF的OD490、PI显著增高，小剂量长时间作用也有类似作用。结论：双黄复方对smc和ccc-esf生长均有促增殖作用。
[中图分类号] R329.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）05（a）-027-03
Effects of Shuanghuang Herbal Medicine Compound on the proliferation of SMC and CCC-ESF
FENG Daxing1, LI Yang2
(1.The Second People's Hospital of Baiyun District of Guangzhou City, Guangzhou 510450, China; 2.Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China)
[Abstract] Objective: To study the effects of Shuanghuang Herbal Medicine Compound SHMC on the proliferation of SMC and CCC-ESF. Methods: MTT was used to determine the proliferation at different concentrations and times of SHMC, and flow cytometry technique was used to detect the effects on the cell cycle of the two kinds of cells. Results: After treated by SHMC, the OD490 of SMC in each group increased markedly and the percentage of cells at G2/M phase increased markedly compared with blank control group, but the proliferation of SMC showed no relationship with the dose of SHMC. A large dose of SHMC significantly increased the OD490 and PI of CC-ESF in short time, and low dose also showed similar effects in a long time. Conclusion: SHMC could increase the proliferation of SMC and CCC-ESF.
[Key words] Shuanghuang Herbal Medicine Compound; SMC; CCC-ESF; Proliferation
压疮是人体局部血液循环受阻引起的局部皮肤溃烂和组织坏死的常见临床护理并发症，发生率为5.1％～32.1％，因缺乏特效药物，压疮已成为临床护理的一个难题[1-2]。双黄复方由黄柏、黄芩2味药组成，根据临床观察，该制剂能够治疗深肌脓肿、久卧压疮等病症。本实验以兔主动脉平滑肌细胞（SMC）和人胚胎成纤维细胞（CCC-ESF）为研究对象，考察双黄复方对细胞增殖的影响，初步探讨双黄复方的祛腐生肌作用。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
胰蛋白酶（Trypsin）、二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、DMEM培养基干粉均为Gibco产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma公司）。SMC和CCC-ESF购自中国医学科学院。双黄复方（批号2000710），本院制剂。双黄复方浓缩液的制备：取15 g粉末混悬于150 ml超纯水中，浸泡24 h后过滤，滤液于65℃水浴浓缩。取浓缩物溶于5 ml高糖DMEM培养液中，过滤除菌，置4℃冰箱保存备用。
1.2 主要仪器
流式细胞仪（BECKMAN 公司）、酶标仪（Bio-Rad公司）、细胞培养温箱等。
1.3 实验方法
1.3.1 双黄复方对SMC增殖的影响根据文献[3]，取对数生长期SMC细胞，以0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化，离心洗涤，用含血清培养液调整细胞浓度至1.5×105/ml。实验分为对照组和双黄复方剂量组：取96孔板，各孔加入细胞悬液100 μl，并加入终浓度依次为0.25、0.50、5.00、10.00、20.00 mg/ml的双黄复方，每个浓度设3个复孔。将培养板置入37℃，5% CO2温箱培养，分别于6、12、24、36、48 h取出培养板，加入20 μl 5 g/ml MTT溶液，继续培养4 h后，弃培养液，加入100 μl DMSO，轻轻振荡10 min，以酶标仪测定各孔OD490值，取3个孔OD490的均值。
1.3.2 双黄复方对SMC细胞周期的影响同“1.3.1”法双黄复方作用细胞48 h后，以0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化收集细胞，4℃、70%冰乙醇溶液固定24 h，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入PBS重新悬浮，重复上述步骤离心2次，充分洗涤固定细胞，加入PI染液500 μl，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期，通过Multicycle软件分析细胞DNA含量，自动拟合细胞周期各时相百分比。
1.3.3 双黄复方对CCC-ESF增殖的影响根据文献[4-5]，取对数生长期CCC-ESF细胞，以0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化，离心洗涤，用含血清培养液调整细胞浓度至1.5×104/ml。实验分为阴性对照组和双黄复方5个剂量组：取96孔板，各孔加入细胞悬液100 μl，并加入终浓度依次为0.25、0.50、5.00、10.00、20.00 mg/ml的双黄复方，每浓度设3个复孔。将培养板置入37℃，5% CO2温箱培养，分别在6、12、24、48、72 h，取出相应培养板，其他操作见“1.3.1”，同法测定各孔OD490值，取3孔OD490的均值。
1.3.4 双黄复方对CCC-ESF细胞周期的影响同“1.3.3”双黄复方作用细胞24、48、72 h后，按“1.3.2”步骤采用流式细胞仪检测双黄复方对CCC-ESF细胞周期的影响，并计算其增殖指数[PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）]。
1.4 统计学方法
数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 双黄复方对SMC增殖的影响
与对照组比较，不同浓度的双黄复方作用6 h后，SMC的OD490显著增高；10.00 mg及20.00 mg/ml组作用24、36 h的OD490增高也较明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义；但SMC的生长与双黄复方的作用剂量依赖关系不明显，提示双黄复方对SMC细胞有明显的促增殖作用，结果见表1。
2.2 双黄复方对SMC细胞周期的影响
实验中24、36 h各组各期细胞比例无明显差别。双黄复方作用48 h后，与空白对照组比较，0.25 mg/ml剂量组G2/M期细胞比例无增高，中高剂量组（5.00～20.00 mg/ml组）的G2/M期细胞比例明显增高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表2。
2.3 双黄复方对CCC-ESF增殖的影响
如表3所示，与空白对照组比较，双黄复方作用6 h后，5.00、10.00、20.00 mg/ml组的OD490显著增高，12 h后10.00 mg/ml组的OD490明显增高，24 h后10.00、20.00 mg/ml组的OD490增高显著；但作用48 h后10.00、20.00 mg/ml组OD490降低明显，而作用72 h 0.25、0.50、5.00 mg/ml组的OD490显著增高，与对照组比较，有显著性差异，提示大剂量双黄复方在短时间内对CCC-ESF有促增殖作用，但长时间反而抑制其生长；小剂量短时间无影响，但随着作用时间的延长，对CCC-ESF同样有促增殖作用。
2.4 双黄复方对CCC-ESF增殖指数的影响
如表4所示，双黄复方作用24 h后，大剂量组的PI增高，与空白对照组比较，有显著性差异，其他时间点各组的PI值与对照组比较无显著性差异。这可能是因为大剂量的双黄复方对CCC-ESF有一定的细胞毒作用，造成部分细胞死亡（镜下可见作用48 h后，10.00、20.00 mg组有部分细胞死亡），而存活的细胞可耐受，继续生长，并进入正常的分裂周期。
表4 双黄复方对CCC-ESF细胞增殖指数的影响（x±s）
3 讨论
临床上压疮根据其发展分为四级：1级皮肤完整，出现以指压不会变白的红印；2级表皮或真皮受损，但尚未穿透真皮层，伤口会出现皮损，水疱或小浅坑；3级表皮或真皮全部受损，但尚未穿透筋膜及肌肉层，伤口会出现深凹形状，伤口基部与伤口连接处可能有潜行凹洞；4级皮肤广泛性破坏，伤口深及皮肤组织、筋膜、肌肉或骨头。因缺乏有效的药物，压疮已成为护理的一个难题。双黄复方为防治压疮专配的中药复方，根据临床观察，该制剂对治疗深肌脓肿、久卧压疮等具有显著的疗效。
双黄复方由黄柏、黄芩2味药组成，黄柏具有较多的生物碱（主要是小檗碱），对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等多种细菌均有显著的抑制作用，具有清热解毒、治疮疡肿毒等作用，《用药心法》曰“治疮痛不可忍者”[6]。而黄芩含有黄芩苷等成分，具有抗感染、抗变态反应、抑菌和解热镇静等药理作用，主治恶疮疽蚀，《科学的民间药草》记载“外洗创口，有防腐作用”[7]。以上分析可见，双黄复方具有针对压疮典型症状的中药组成及有效成分，这与临床上观察到的治疗效果一致。双黄复方对压疮的防治除了抗感染、抑菌、镇痛等作用外，是否在祛腐生肌方面具有促进作用，本研究结果提示，双黄复方对主动脉平滑肌细胞和人胚胎成纤维细胞的增殖均具有明显的促增殖作用，为溃疡组织的再生提供了良好的修复条件，从而使肉芽生长延伸，促进创面的愈合，防治压疮。
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（收稿日期：2009-02-06）