基于选择性剔除的红花抗氧化效应物质基础研究
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[摘要] 目的：建立一种从整体角度研究中药效应物质的方法。方法：以红花为例，利用制备液相色谱剔除其主要成分，然后分别对剔除后的样品进行抗氧化效应评价，进而比较分析得出红花抗氧化活性的主要效应物质及各成分的贡献度。结果：从红花样品中分别剔除了7个主要物质，并通过质谱数据分析和对照品对照鉴定了其中6个成分。通过对包括剔除物质在内的所有样品进行抗氧化效应比较评价，结果发现羟基红花黄色素A，脱水红花黄色素B，6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷是红花抗氧化活性的主要效应物质。结论：该研究探索了一种较新颖而有效的中药效应物质的研究方法，通过这种方法，能从一定程度上阐明不同成分对中药效应表达直接或间接的贡献以及贡献度，使得中药效应物质表达更加明晰。
[关键词] 选择性剔除；红花；抗氧化；效应物质
中药在中医理论指导下为广大民众应用数千年，疗效确切，其发挥疗效的是中药所含的复杂物质基础[1]。近年来，随着现代分析、分离技术的不断发展，中药物质基础研究取得了较大进展，新思路和新方法不断涌现，如基于组合化学或化学物质组学概念的中药药效物质基础研究、血清药物化学与血清药理学相结合的研究方法、基于谱效关系或组效关系的中药物质基础研究、基于亲和色谱和分子烙印技术的中药物质基础研究、基于药物代谢的中药物质基础研究、基于计算机虚拟筛选技术的中药物质基础研究等[2]。但这些研究方法大多仅从某一侧面或模糊地研究中药物质基础，其“发现”的有效成分往往都是传统方法早已确证的有效成分，难以真正地阐明中药物质基础及其相互作用，且无法完整地将不同功效活性归属于目标成分。如有正反两方面的数据，即含有该成分有活性反应，去除该成分则活性减弱甚至消失，可明确地将该活性归属于目标成分，从而完成中药有效成分的辨识。
制备液相色谱系统在中药研究中大多应用于化学成分的分离和纯化，鉴于现代制备液相色谱高效的分离性能及收集触发功能可以尝试用于进行中药中成分或化学特征部位的剔除。本研究即以红花为例，利用制备液相色谱技术分别剔除红花中的不同成分，结合活性实验，评价这些成分在中药效应表达中的贡献，进而阐明红花效应物质，这将为中药物质基础研究提供一种新的思路与方法。
1材料
1.1药物及试剂
红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，产于新疆，并经南京中医药大学王春根教授鉴定，符合《中国药典》2010年版项下标准。
腺苷（99%，Sigma公司），羟基红花黄色素A（92.5%，江苏省食品药品检验所）。FeSO4·7H2O，水杨酸，过氧化氢（H2O2）购买于无锡市亚盛化工有限公司；DPPH（1，1-di-phenyl-2-picryhydrazyl）购自于ALDRICH Chemistry；ABTS（2，2′-azinobis-3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid）、三吡啶三嗪（2，4，6-tripyridyl-s-triazine，TPTZ）购自于Sigma公司。超纯水自制，甲醇（色谱纯，中国汉邦），其他试剂均为分析纯。
1.2仪器
旋转蒸发仪（BUCHI labortechnik AG，瑞士）；超纯水仪（南京易普易达科技发展有限公司）。Waters 2695-2998 PDA，Hypersil ODS2分析色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）。Waters自动纯化系统（2545二元高压梯度泵，2767自动进样及收集器，泵控制器，2489双波长检测器；FractionlynxTM工作站），XBridgeTM C18 OBDTM制备柱（30 mm×150 mm， 5 μm）。Enspire型多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。
2方法
2.1制备用样品制备
称取红花药材400 g，精密称定，浸泡30 min，分别用24倍和20倍量30%乙醇，80 ℃下温浸2次，每次各60 min，趁热过滤，60 ℃以下减压浓缩至约生药1 g·mL-1，此即为红花样品（HH）。
2.2红花不同成分的剔除
称取上述各样品适量，10%甲醇溶解，质量浓度约为300 g·L-1，13 000 r·min-1离心10 min，上清液注入制备液相系统，进样体积为500 μL；流动相为水（A）-甲醇（B）；流速20 mL·min-1；检测波长270 nm（各目标成分在此波长下均有较强吸收）；根据不同成分确定不同的洗脱程序，各成分的最佳洗脱程序见表1。依据保留时间分别收集目标成分1～7，10 mL/管，同时收集剔除目标成分的溶液，60 ℃以下减压回收，即得到目标成分（C1～C7）和分别剔除目标成分后的部分（HH1～HH7）。
2.3剔除结果分析与成分鉴定
2.3.1HPLC分析条件 上述剔除前后样品（HH及HH1～HH7）和剔除成分（C1～C7）适量，10%甲醇溶解，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液进HPLC分析，柱温30 ℃，进样体积10 μL，流动相为0.5%乙酸水（A）-甲醇（B），流速0.8 mL·min-1，梯度洗脱程序：0 min（5%B），10 min（5%B），25 min（25%B），40 min（30%B），60 min（55%B），75 min（90%B）。PAD检测器波长扫描范围210～400 nm。
2.3.2HPLC-Q-TOF-MS分析条件 色谱条件与上述一致。质谱检测条件：ESI源，扫描方式：ESI+，ESI-模式，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40 V，萃取电压2.0 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度250 ℃，锥孔气流量50 L·h-1，脱溶剂气流量600 L·h-1，离子能量1 V，每0.2 s采集1次图谱；准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽（1eucine-enkephalin，ESI+：m/z 556.277 1，ESI-：m/z 554.261 5）溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围m/z 50～1 500。
2.4抗氧化活性研究
2.4.1抗氧化用样品制备 精密称取各剔除目标成分前后浓缩液，精密称定，配成生药5 mg·L-1，并取适量稀释成0.156 mg·L-1。前者作为DPPH自由基清除率测定和FRAP法测定的样品，后者用于测定ABTS自由基清除率。
2.4.2DPPH清除率的测定 分别用移液枪移取上述供试品溶液0.1 mL于96孔板中，每列8个复孔加入同一个样品，5个复孔加入0.1 mL DPPH溶液，3个复孔加入0.1 mL无水乙醇扣除药物本底颜色对实验的影响，待各溶液加入完毕，避光反应30 min后在517 nm波长下用酶联免疫检测仪测定其吸光度，溶剂空白加DPPH后的吸光度为A0，溶剂空白加无水乙醇后的吸光度为A0′，供试品加DPPH后的吸光度为A1，供试品加无水乙醇后的吸光度为A1′，按下述公式计算各供试品对DPPH自由基的清除能力[3-5]。
2.4.3ABTS清除率的测定 用去离子水将ABTS和K2S2O8（过二硫酸钾）分别溶解并混合，使其终浓度分别为7，2 mmol·L-1，在室温、避光条件下静置12～16 h，得到ABTS储液。测定时用PBS（pH 7.4）稀释到734 nm处吸光度为（0.7±0.02），-20 ℃保存备用。反应在96孔板中进行，200 μL反应液中含有100 μL不同浓度的样品或参比溶液、100 μL的ABTS反应溶液（每列8个复孔加入同一个样品，5个复孔加入ABTS溶液，3个复孔加入去离子水扣除药物本底颜色对实验的影响）。振荡摇匀，于室温下避光静置6 min，测定溶液在734 nm处的吸光值。A0为溶剂与ABTS反应溶液作用后的吸光度，A0′为溶剂加去离子水后的吸光度，A1为受试物与ABTS反应液作用后的吸光度；A1′为受试物中未加ABTS反应溶液时的吸光度[6-8]。ABTS自由基清除率的计算公式与DPPH法一致。
2.4.4还原Fe3+能力测定（FRAP法） 用去离子水分别配置2 mmol·L-1的FeCl3和TPTZ溶液，于实验前将两者按1∶1体积比混合，混合液加入96孔板中，每孔100 μL，然后加入不同浓度受试物，每孔100 μL，振荡均匀，在室温下静置30 min，于593 nm处测吸光度，A越高，表明还原Fe3+的能力越强[9-10]。样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的物质的量（mmol）表示，其标准方程[11]为y=14.65x-0.008 1，R2=0.992。
2.5统计学处理
实验数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P
3结果
3.1制备液相剔除结果分析
从红花中剔除7个成分（图1），用分析型HPLC检验剔除结果。各剔除成分用全波长扫描分析结果显示，纯度均达到80%以上，比较分析剔除前后的色谱图，结果显示7个成分均分别从红花中被基本剔除。用该方法共获得14个样品，分别是分别剔除7个成分外的剔除后溶液（HH1～HH7），以及剔除的7个目标成分（C1～C7）。结果显示，可以将剔除成分及剔除前后溶液作为后续活性评价用的样品。
3.2剔除成分鉴定
根据紫外图谱将剔除成分初步分为3类，即黄
根据实验结果对几种主要活性成分在红花抗氧化能力中贡献度进行比较，结果发现，对DPPH自由基清除率的贡献大小：3>7>4>6>2，对ABTS自由基清除率的贡献大小：4>2>6，对Fe3+的还原能力的贡献大小：6>7>5>3>2>1>4。单体成分作用大小比较结果，对DPPH自由基清除率的影响：2>6>5>3>7>1>4，对Fe3+的还原能力的作用：2>6>5>4>1>3>7，而各成分在实验浓度下对ABTS自由基清除均无显著活性。结果显示，不同单体成分对3种抗氧化活性作用大小相似，但与该成分在红花中的作用贡献比较不完全一致，尤其是6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷（4）、羟基红花黄色素A（2）和脱水红花黄色素B（6）3个成分本身都无ABTS自由基清除活性，但在红花整体ABTS自由基清除效应中都表现出了明显的贡献。
4讨论
红花是活血化瘀的传统中药，是治疗心脑血管疾病方剂的主要配方药物，具有抗血小板聚集、抗凝血等多种相关药理活性，许多文献报道红花也具有明显的抗氧化活性，降低细胞氧化损伤，其抗氧化作用也与治疗心肌缺血、脑缺血等心脑血管疾病密切相关[17-19]。本研究采用制备液相剔除技术与抗氧化效应评价相结合，探索了一种较新颖而有效的中药效应物质的研究方法，通过这种方法，能从一定程度上阐明不同成分对中药效应表达直接或间接的贡献以及贡献度。结果表明，羟基红花黄色素A，脱水红花黄色素B，6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷在红花抗氧化效应上不仅直接发挥作用，也通过影响其他成分而间接发挥效应，是对红花抗氧化活性有重要贡献的成分组成。
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Study on material base of Carthamus tinctorius with antioxidant
effect based on selective knock-out
WANG Lin-yan， TANG Yu-ping*， LIU Xin， GE Ya-hui， LI Shu-jiao， SHANG Er-xin， DUAN Jin-ao
（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicinal Resources Industrialization，
Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）
[Abstract] Objective： To establish a method for studying efficacious materials of traditional Chinese medicines from an overall perspective. Method： Carthamus tinctorius was taken the example. Its major components were depleted by preparing liquid chromatography. Afterwards， the samples with major components depleted were evaluated for their antioxidant effect， so as to compare and analyze the major efficacious materials of C. tinctorius with antioxidant activity and the contributions. Result： Seven major components were depleted from C. tinctorius samples， and six of them were identified with MS data and control comparison. After all of the samples including depleted materials are compared and evaluated for their antioxidant effect， the findings showed that hydroxysafflor yellow A， anhydrosafflor yellow B and 6-hydroxykaempferol-3， 6-di-O-glucoside-7-O-glucuronide were the major efficacious materials. Conclusion： This study explored a novel and effective method for studying efficacious materials of traditional Chinese medicines. Through this method， we could explain the direct and indirect contributions of different components to the efficacy of traditional Chinese medicines， and make the efficacious material expression of traditional Chinese medicines clearer.
[Key words] selective knock-out； Carthamus tinctorius； anti-oxidation； efficacious materials
doi：10.4268/cjcmm20140727