基于临床药效剂量下的吴茱萸镇痛及伴随毒副作用研究

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[摘要] 目的： 对吴茱萸水提组分发挥镇痛药效剂量下出现的伴随毒副作用及其机制进行观察与研究，为阐明其“功效-毒性”相关性提供实验依据。方法：小鼠按体重随机分为5组，即正常对照组、扶他林组、吴茱萸水提组分高、中、低剂量组，连续给药7 d，末次药后90 min采用小鼠腹腔注射醋酸致痛法及小鼠热板法疼痛模型，观察其在发挥药效作用时的伴随毒副作用；除观察小鼠毒性症状外，检测血清和肝脏组织谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性，以及血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量，计算肝、肾脏器指数；另取一部分血清检测前列腺素E2（PGE2）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的含量和活性。结果：连续多次给小鼠灌胃药效剂量下的吴茱萸水提组分，可显著减少小鼠扭体反应次数和明显提高小鼠热板痛阈值，且呈现良好的“量-效”关系；给药期间，小鼠出现腹泻、怠动、烦躁、体重增长缓慢等毒性症状；给药7 d后，血清和肝组织内ALT，AST活性均升高，肝体比值明显增大，血清BUN，Cr含量无明显变化，肾体比值只有高剂量组出现增大；血中PGE2，SOD，GSH，GSH-PX含量和活性明显下降，MDA，NO，NOS含量和活性明显升高。上述变化随剂量的增加而逐渐加重，与对照组比较有明显差异，呈现一定的量-毒关系。结论：连续给小鼠灌服一定剂量的吴茱萸水提组分，其在发挥镇痛药效的同时会对肝脏产生一定的毒副作用，并呈现一定的剂量依赖关系；其镇痛机制与降低血中PGE2含量有关，其毒性机制与氧化损伤有一定相关性。

[关键词] 吴茱萸；水提组分；镇痛；伴随毒副作用

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa （Juss） Benth.、石虎E. rutaecarpa （Juss） Benth var. officinalis （Dode） Huang或疏毛吴茱萸E. rutaecarpa （Juss） Benth.var. bodinier （Dode） Huang.的干燥近成熟果实。辛、苦、热，有小毒，归肝、脾、胃、肾经，能散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻[1]。吴茱萸始载于《神农本草经》，列为中品，为温中止痛的必备药，在许多方剂中皆有配伍应用，但随着近年来吴茱萸临床不良反应报道的日益增多，且以肝损害为主，吴茱萸的毒性引起了人们的高度重视。中药药性理论是以功效为核心，以物质为基础，性、味、归经、有毒无毒等要素相互关联的复杂理论，构成中药药性理论的3个核心要件是药性、物质、功（毒）效。中药的毒性是在中医理论指导下，临床辨证用药和功效表征过程中被逐渐发现和认识的，其功效和毒性的表达密切相关。关于吴茱萸研究截止到目前为止也多是单一的药效或毒性报道，没有吴茱萸关于发挥药效与毒性的剂量范围研究与报道。由于效毒二重性是药物作用的基本特性[2]，因此笔者认为有必要进行中药“功效-毒性”相关性的研究，即在进行其功效研究的同时考察其毒副作用的表达，不能孤立地“就功效论功效，就毒性论毒性”。基于上述理论的指导，本研究主要对镇痛有效剂量范围内产生的伴随毒副作用进行了观察与研究，为进一步锁定产生毒副作用的物质基础、明确剂量范围、有助于临床ADR诊疗标准构建，提供药理、毒理学基础研究数据。

1 材料

1.1 药品

吴茱萸药材购自安徽亳州市鲁康药材站（批号20090617），经山东省中医药研究院林惠彬研究员鉴定为芸香科植物吴茱萸E. rutaecarpa的干燥近成熟果实，按2005年版《中国药典》吴茱萸项下检查，符合各项规定。吴茱萸水提组分（批号20090709），由本试验室提取制备，现用现配。吴茱萸水提组分样品制备：取吴茱萸药材1 500 g，分别加10，8，8倍量水加热回流提取3次，每次1 h，16层纱布滤过、合并滤液，浓缩至所需浓度。

1.2 动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，适龄、健康，共180只，购自山东大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（鲁）2009-0001。

1.3 仪器与试剂

PL303精密电子天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司）；可调式移液器（上海赛默飞世尔仪器有限公司）；560全自动生化分析仪（德国贝尔公司）；DDL-5型低速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；DZKM-S-6电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；UV-2102型紫外分光光度仪（中美合资尤尼柯有限公司）。氢氧化钾（分析纯，天津市广成化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；ALT，AST，BUN，CR，MDA，SOD，NO，NOS，GSH，GSH-PX测定试剂盒购自南京建成股份有限公司。

2 方法

2.1 动物分组与给药

取小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，即正常对照组、扶他林对照组、吴茱萸水提组分高、中、低剂量组。根据扶他林人日用量为0.1 g，按体表面积比值折算为等效剂量的2倍，即设定小鼠剂量为0.026 g·kg-1，用蒸馏水将其溶解。根据吴茱萸水提组分经口急性毒性试验结果和临床常用剂量为依据，设定吴茱萸水提组分高、中、低剂量组分别为2.5，1.25，0.63 g·kg-1，均按25 mL·kg-1每天灌胃1次，对照组灌服等体积蒸馏水，药物组各剂量组分别灌服一定剂量的药物，连续给药7 d。

2.2 对小鼠腹腔注射醋酸致扭体反应的影响[3]

上述小鼠稳定3 d进入试验，小鼠连续灌胃7 d，给药期间观察小鼠体重、饮食饮水、毛色等一般状况。在末次给药后90 min，腹腔注射0.6%的醋酸10 mL·kg-1，立即计时，记录小鼠第1次发生扭体的时间（即扭体潜伏期）和15 min内小鼠发生扭体反应的次数，并计算抑制率。扭体反应的典型症状表现为腹部内凹，躯干与后肢伸张，臀部高起。抑制率=（对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/对照组平均扭体次数×100%。

测完后，即刻取血，3 000 r·min-1离心10 min，取血清，按相关试剂盒说明书的操作说明，测定血清ALT，AST，BUN，CR水平；取血后剖取小鼠肝、肾等脏器称重并计算脏器指数；另取一部分肝组织迅速冻存，以备测定肝组织内的ALT，AST水平。由于在前期研究中，发现吴茱萸水提组分小鼠肾脏病理组织学检查未见组织学改变，故本研究只做了肝脏病理组织学的检查。取一部分肝组织，常规HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学变化。对肝组织形态进行病理分级、积分：肝组织结构正常，无明显变性、坏死及炎症细胞浸润，0分；肝小叶结构尚正常，可见明显的混浊肿胀、气球样变或脂肪变性，散在点状坏死（+），1分；肝小叶结构不清，可见明显的灶状坏死，伴有炎症细胞浸润（），2分；肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死，伴有炎症细胞浸润（），3分；坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，层次较多，伴有炎症细胞浸润（），4分。

2.3 对小鼠热板法实验的影响

按文献方法进行热板实验[4]。测定痛阈时实验室温度控制在15 ℃左右，恒温水浴温度控制为（55±1） ℃。实验时将1只小鼠放在55 ℃的铝板上，立即记时，以小鼠舔后足为疼痛反应指标，自小鼠放在热板上至其出现舔后足的时间（s）为其痛觉阈值。选痛觉阈值在5～30 s的雌性小鼠50只，随机分为5组，每组10只。小鼠分组与给药方法同2.1项。在末次给药后90 min按上述方法测痛阈。痛阈>60 s按60 s。测完后，即刻取血，3 000 r·min-1离心10 min，取血清，指标检测及病理组织学检查同2.2项。

2.4 镇痛机制及伴随肝毒性机制研究

在末次给药后90 min，取血3 000 r·min-1离心10 min，取血清，按相关操作说明，用紫外法测定血PGE2，MDA，SOD，NO，NOS，GSH和GSH-PX水平。取血后剖取小鼠肝脏迅速冻存，以备测定肝组织内的MDA，SOD，NO，NOS，GSH和GSH-PX水平。

2.5 统计学方法

数据用±s表示，采用SPSS 11.5统计软件对各组参数进行单因素方差分析。进行组间比较，P

3 结果

3.1 吴茱萸水提组分镇痛功效及机制研究

3.1.1 吴茱萸水提组分对小鼠腹腔注射醋酸致扭体反应的影响 扶他林阳性药组与对照组比较均呈现极显著性差异，显示出较好的镇痛效果。吴茱萸水提组分高、中、低剂量组均可显著延长小鼠发生扭体的潜伏期，并减少15 min内小鼠发生扭体反应的次数，与对照组比较，分别呈现极显著性差异、非常显著性差异和显著性差异，且呈现一定的剂量依赖关系，但镇痛效果不及扶他林，见表1。

3.1.2 吴茱萸水提组分对小鼠热板法痛阈的影响 扶他林阳性药组与对照组比较呈极显著性差异，显示出较好的镇痛效果。吴茱萸水提组分高、中、低剂量组均可显著提高小鼠痛阈值，与对照组比较，分别呈现非常显著性差异、非常显著性差异和显著性差异，且呈现一定的剂量依赖关系，但镇痛效果不及扶他林，见表2。

3.1.3 吴茱萸水提组分对小鼠镇痛血清机制指标研究 与对照组比较，PGE2含量和SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，且随剂量增大，变化程度增大，呈现一定的剂量依赖关系，见表3。

3.2 吴茱萸水提组分伴随毒副作用及机制研究

3.2.1 一般情况观察 在7 d实验期内，对照组小鼠一般活动正常、毛色光亮、进食饮水均正常、未见粪尿的异常改变。扶他林组出现行为倦殆、欠活泼，毛色无光、稀松、掉毛，进食、饮水欠佳；吴茱萸水提组分给药后出现的主要症状为腹泻，轻度怠动，毛色无光，进食、饮水欠佳。给药后，小鼠体重自身增长缓慢，与对照组比较，扶他林组在药后第3天开始出现统计学差异，持续到第7天，吴茱萸水提组分高剂量组在药后7 d出现统计学差异。对小鼠体重变化的影响见表4。

3.2.2 血生化指标检测 对照组小鼠血清和肝内ALT，AST指标水平均在正常范围内。扶他林组血ALT，AST活性与对照组比较分别呈显著性差异和极显著性差异，肝内ALT，AST活性与对照组比较分别均呈显著性差异，提示扶他林可以产生一定的肝毒性损伤。吴茱萸水提组分高、中、低剂量组血清和肝内ALT，AST水平明显升高，与对照组比较呈现不同程度的显著性差异，呈现一定的剂量依赖关系。提出，吴茱萸水提组分在产生镇痛效果的同时，对肝脏会产生一定毒副作用，见表5，6。表6结果显示，对照组小鼠血清BUN，CR指标水平均在正常范围内。扶他林组血BUN，CR水平与对照组比较均呈显著性差异，提示扶他林可能会对肾脏产生一定的毒副作用。吴茱萸水提组分高、中、低剂量组血清BUN，CR水平未见明显升高，与对照组比较无统计学差异，提出，吴茱萸水提组分在产生镇痛效果的同时，对肾脏可能不会产生毒副作用。

3.2.3 重要脏器指数检测 扶他林均可导致小鼠肝体和肾体比值增加，与对照组比较，呈现极显著性差异和显著性差异。吴茱萸水提组分高、中、低剂量组均可导致肝体比值增加，且随着剂量增大，肝体比值逐渐增加，呈现一定的剂量依赖关系；只有高剂量组出现肾体比值增加，与对照组比较，呈现显著性差异，考虑到血里肾功指标基本正常，提示肾体比值增加可能系非毒性损伤，见表7。

3.2.4 吴茱萸水提组分对小鼠药效伴随毒副作用血清机制指标研究 对照组小鼠血清MDA，SOD，NO，NOS，GSH，GSH-PX指标水平均在正常范围内。与对照组比较，扶他林和吴茱萸水提组分组SOD，GSH，GSH-PX含量和活性明显下降，MDA，NO，NOS含量和活性明显升高，且随剂量增大，变化程度增大，呈现一定的剂量依赖关系，见表8。

3.2.5 病理组织学检查 吴茱萸水提组分小鼠药效伴随毒肝组织Riddit 分析病理积分见表9。可见光镜下观察，对照组肝小叶结构清晰完好，肝细胞未见明显变性、坏死，肝窦未见明显淤血扩张，肝组织Riddit分析病理积分在正常范围内；扶他林肝组织Riddit分析病理积分与对照组比较呈现非常显著性差异；吴茱萸水提组分高、中剂量组呈现明显的病理变化，Riddit分析病理积分与对照组比较呈现非常显著性差异和显著性差异。可见，连续给药7 d，可引起小鼠肝脏组织的病理学变化，提示，应对临床应用中可能的肝毒副作用提出预警，避免引起不可逆的病理组织损伤。

4 讨论

功效与毒性是药物作用的基本特性。古人对于“毒效”的认识早有文献记载。其一，古人对药毒不分，认为凡可治疗疾病的药物皆称为毒药，因此有“毒”即是“药”的说法，如《周礼·天宫》篇有“医师掌医之政令，聚毒药以供医事”的记载；《医学问答》中称：“夫药本毒物，故神农辨百草谓之尝毒，药之治病，无非以毒拔毒，以毒攻毒”。其二，“毒”即药物的偏性。古人认为，中药之所以能够治病，是利用中药具有的偏性来驱邪扶正，纠正机体气血阴阳之偏颇，以使之恢复平衡，从而达到治愈疾病的目的，如明代张景岳《类经》中云：“药以治病，因毒为能……是凡可辟邪安正者，均可称为毒药”；清代景日昣在《嵩崖尊生书》中指出：“一药之生，其得寒、热、温、凉之气，各有偏至，以成其体质，故曰药。药者，毒之谓。设不偏，则不可以救病之偏也。”以上即是偏胜之性的“毒”。其三，“毒”即药物的不良反应。《神农本草经》中即明确指出：“药物有大毒，不可入口、鼻、耳、目者，即杀人，一曰钩吻，二曰鸱”。这里的“毒”指的是那些药性强烈，服后容易出现不良反应的药物。可见，中药的毒性是在中医理论指导下，在长期临床应用观察和经验积累的医疗实践基础上发展而来，是在其临床功效的表征过程中被逐渐发现和认识的，因此，中药的功效与毒性密切相关。吴茱萸是临床常用中药，是温中止痛的必备药，在许多方剂中皆有配伍应用，但随着近年来吴茱萸临床不良反应报道的日益增多，且以肝损害为主，吴茱萸的毒性引起了人们的高度重视。基于上述理论的指导，笔者对吴茱萸水提组分在发挥镇痛功效时其伴随毒副作用情况进行了初步研究，以为阐明其“功效-毒性”相关性提供实验依据。

本研究结果表明，连续多次给小鼠灌胃药效剂量下的吴茱萸水提组分具有较好的镇痛效果，连续7 d给小鼠灌胃一定剂量的吴茱萸水提组分，可显著减少小鼠扭体次数和明显提高小鼠痛阈值，且呈现良好的量-效关系，由实验结果可知，0.63 g·kg-1剂量下即可显著减少小鼠扭体反应次数和明显提高小鼠热板痛阈值。但连续多次给药在发挥镇痛效果的同时可对小鼠肝脏产生一定的毒副作用，具体表现为给药期间小鼠出现腹泻、怠动、烦躁、体重增长缓慢等毒性症状；血生化指标检测显示，血清和肝组织内ALT，AST活性均升高，肝体比值明显增大，血清BUN，Cr含量无明显变化，肾体比值只有高剂量组出现增大；血中PGE2，SOD，GSH，GSH-PX含量和活性明显下降，MDA，NO，NOS含量和活性明显升高；上述变化随剂量的增加而逐渐加重，与对照组比较有明显差异，呈现一定的剂量依赖关系。

上述实验结果表明，连续给小鼠灌服一定剂量的吴茱萸水提组分，其在发挥镇痛药效的同时会对肝脏产生一定的毒副作用，肝脏为主要的毒性靶器官，并呈现一定的剂量依赖关系，其镇痛机制与降低血中PGE2含量有关，其毒性机制与氧化损伤有一定相关性。初步证明了中药的“毒效”相关性，初步提示中药在发挥疗效的同时会产生一定的毒副作用，其严重程度与用药剂量密切相关，提示临床用药期间，应定期检测肝功，密切观察其毒副作用的发生。对于吴茱萸水提组分的“药效剂量窗”和“毒性剂量窗”、以及其镇痛机制、伴随毒副作用机制有待于进一步深入研究，以为合理控制吴茱萸毒性、保证吴茱萸及其制剂在临床的安全有效应用提供依据。

[参考文献]

[1] 中国药典.一部[S].2005：160.

[2] 梁琦，谢鸣.中药毒性及其内涵辨析[J].中西医结合学报，2009，7（2）：101.

[3] 徐叔云，卞如濂，陈修.药理学实验方法学[M].2版.北京：人民卫生出版社，1992.

[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1996.

Study on analgesic and accompanying toxic and side effects of Euodiae Fructus based on clinical efficacy dose

HUANG Wei， SUN Rong*

（Shandong Academy of China Medicine， Ji′nan 250014， China）

[Abstract] Objective： To observe and study the toxic and side effects of water extracts from Euodiae Fructus accompanied with its efficacy analgesic dose and its mechanism， in order to provide experimental basis for the correlation between its "efficacy-toxicity". Method： Mice were randomly divided into 5 groups according to weight， namely the normal group， the voltaren group， and Euodiae Fructus water extracts high， middle and low dose groups. Mice were administered with drugs for consecutively seven days， abdominally injected with acetic acid at 90 min and treated with hot plates after the last administration to establish the pain model， in order to the toxic and side effects accompanied with the efficacy. Besides toxic symptoms in mice， activities of ALT and AST， and content of BUN and Cr in serum were detected to calculate indexes in livers and kidneys. The other part of serum was collected to detect the content and activities of PGE2， MDA， SOD， NO， NOS， GSH and GSH-PX in serum. Result： Continuous oral administration of water extracts from Euodiae Fructus of efficacy dose could significantly decrease the frequency of writhe in mice and increase the hot plate pain threshold， with good dose-efficacy relationship. During the administration， mice showed such toxic symptoms as diarrhoea， idle move， dysphoria and slow growth of weight. The activities of both ALT and AST in serum and hepatic tissues were remarkably increased and the liver size remarkably increased， without notable chance in content of BUN and CR in serum. Kidney size increased in only the high dose group. The content and activities of PGE2， SOD， GSH， GSH-PX in serum notably decreased， where the content and activities of MDA， NO， NOS in serum increased. The above-mentioned changes gradually aggravated with the rise in dose. There was significant difference compared with the model group， showing ′dose-toxicity′ relationship to certain extent. Conclusion： Continuous oral administration of certain dose of water extracts from Euodiae Fructus to mice can generate the toxic and side effects in liver accompanying with the analgesic effect， and show dose-dependence relationship to some extent. Its analgesic mechanism is related to the reduction of PGE2 content in blood， while its toxic mechanism is related to oxidative injury to some extent.

[Key words] Euodiae Fructus； water extracts； analgesic effect； accompanying toxic and side effects

doi：10.4268/cjcmm20131328