金华火腿粗肽液的体外抗氧化活性
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摘 要：在金华火腿长期加工过程中，蛋白质在内源酶作用下产生了大量不同长短的肽段。提取金华火腿粗肽液，通过测定不同质量浓度粗肽液清除自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化和蛋白质氧化的能力，并与相应质量浓度的丁基羟基甲苯（BHT）和谷胱甘肽（GSH）作比较，衡量金华火腿粗肽液的抗氧化能力。结果表明：随着质量浓度的增加，金华火腿粗肽液的抗氧化能力显著增加。在质量浓度为1.5mg/mL时，金华火腿粗肽液清除羟基自由基能力达到90%；质量浓度为5mg/mL时，金华火腿粗肽液清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力与BHT和GSH相当，高达95%；金华火腿粗肽液螯合金属离子的能力显著高于BHT和GSH；当质量浓度为4mg/mL时，金华火腿粗肽液具有和BHT和GSH相当的抑制脂质过氧化能力，并能一定程度抑制蛋白质氧化。结论：金华火腿粗肽液的抗氧化能力与BHT与GSH相当。
关键词：金华火腿；粗肽液；清除自由基；螯合金属离子；抗氧化活性
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）06-0005-05
金华火腿与如皋火腿、宣威火腿并称中国三大知名火腿，是中国最著名的传统肉制品之一。金华火腿不仅是著名的肉食品，而且具有重要的滋补和药用功能。据记载[1]，金华火腿具有养老补虚、和中安神、开胃宽膈、益肾壮阳、生津血、固骨髓等滋补功能，可用于治疗噎嗝、腹病、虚劳、虚痢、久泻和妇女分娩后蓐劳等症。至今在中国金华地区民间仍保留着用金华火腿作为滋补礼品馈赠亲友及利用金华火腿治疗腹泻、蓐劳等疾病的习俗。
自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的分子或原子，其化学性质相当活跃，会导致对生物体的破坏[2]。科学研究证明，氧自由基几乎和人类大部分常见疾病都有关系，从人类死亡率最高的心脑血管疾病到癌症，都和氧自由基有着密切关系[3]。同时，随着现代食品工业的发展，当前采用的合成类抗氧化剂如丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）等虽然能抑制油脂氧化，却带来食品的安全性问题[4]。因此，近二十年来天然抗氧化剂有了蓬勃的发展，因其毒性小或无毒性且具有一定的保健功能而备受人们的青睐。一些天然抗氧化肽具有重金属清道夫和过氧化氢分解促进剂的作用，可降低自氧化速率，减少脂肪过氧化氢含量，减少自由基的生成[5]。大豆蛋白是目前研究最深入的一种制备抗氧化肽的植物性原料；动物蛋白原料主要包括草鱼、泥鳅等[6-7]。
传统的金华火腿需要加工8～10个月，在此过程中，火腿中的肌肉蛋白质在肌肉内源蛋白酶的作用下产生水解，因此在火腿加工过程中，有大量多肽、小肽产生。Rodriguez等[8]对Sarrano火腿的研究表明，多肽组成可分为5个分子质量范围，即4500～2700、2700～1200、1200～500、500～375u和375～160u。研究发现，在火腿加工过程中，2700u以下的多肽，尤其是1200u以下的多肽数量显著增加，而4500～2700u的多肽数量下降。Flores等[9]发现，在Serrano火腿加工过程中二肽如肌肽和鹅肌肽含量增加。Sforza等[10]对帕尔玛火腿的研究结果也发现，火腿中含有大量的低分子质量多肽，尤其是二肽。
本实验以金华火腿中提取的粗肽液为研究对象，以常用的抗氧化剂BHT和GSH为对照，研究了金华火腿粗肽液对自由基的清除能力，螯合金属离子能力，在模拟脂肪氧化体系中的抗氧化作用以及对蛋白质氧化的抑制作用，以此来衡量金华火腿粗肽液的抗氧化活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
火腿 浙江省金字火腿食品有限公司。火腿按传统加工工艺进行，传统工艺包括摊晾、腌制、浸泡、洗刷、晒腿、成熟和后熟等过程。在样品成熟后随机抽取5块，取股二头肌作为分析样品。样品编号后，在分析测试前于-20℃冰柜中保存。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、丁基羟基甲苯（BHT）、谷胱甘肽（GSH）和2，2'-偶氮二异丁基脒（AAPH） 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯 南京建成化学试剂公司。
1.2 仪器与设备
GM200刀式研磨仪 德国Retsch公司；T25匀浆机 德国IKA公司；Avanti J-E高速冷冻离心机 美国Beekman Coulter公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；ES2030冷冻干燥机 日本Hitachi公司；Spectral Max M2e多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 粗肽液的提取
参照Escudero等[11]的方法进行。取成熟结束的成品股二头肌25g搅碎放入三角瓶中，加入100mL 0.01mol/L HCl溶液，匀浆（22000r/min，4次，每次10s）。之后在4℃、12000×g条件下离心20min。吸取上清液，过滤后加入3倍体积的乙醇，4℃条件下保持20min后，再次在4℃、12000×g条件下离心20min，上清液在旋转蒸发仪上浓缩，浓缩干燥后溶解于去离子水中，在分析测试前于-20℃冰柜中保存。
1.3.2 ・OH清除率测定[12]
羟自由基（・OH）清除率的测定采用邻二氮菲法。反应以H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生羟自由基，总反应可用下式表示：Fe2++H2O2Fe3++OH-+・OH。邻二氮菲-Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+后，其536nm最大吸收峰消失，根据上述原理，以A536nm变化反映羟自由基的氧化作用。
配制蛋白质质量浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL的粗肽液，并以相应质量浓度的GSH和BHT为对照组。样品管：取0.6mL邻二氮菲溶液（5mmol/L）加入0.4mL磷酸盐缓冲液（0.2mol/L、pH7.4）混匀后，加入0.6mL样品溶液及0.6mL EDTA（15mmol/L），再次混匀，之后加入0.6mL FeSO4 溶液（5mmol/L），用去离子水补至体积2.8mL，充分混匀后加入0.8mL H2O2（0.1%），摇匀后于37℃保温1h，测536nm波长处吸光度A536样品；损伤管：以去离子水代替样品，其余步骤同样品管，所测吸光度计为A536损伤；未损伤管：以去离子水代替H2O2，其余步骤同损伤管，所测吸光度计为A536未损伤。・OH清除率计算如下：
・OH清除率/%=（A536样品-A536损伤）/（A536未损伤-A536损伤）×100
1.3.3 DPPH自由基清除率测定
将肽液配成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的粗肽液，测定其清除DPPH自由基的能力，并以相应质量浓度的GSH和BHT为对照组。清除DPPH自由基参照Shimada等[13]的方法。将0.5mL DPPH自由基溶液（0.2mmol/L，溶于95%乙醇）置于试管中，加入0.5mL肽液，振荡混匀，室温放置30min后，在517nm波长处测样品的吸光度，以0.5mL 95%乙醇加入0.5mL蒸馏水为空白，对照组为0.5mL DPPH自由基溶液加上0.5mL 95%乙醇在测定波长下的吸光度。粗肽液对DPPH自由基的清除能力计算如下：
DPPH自由基清除率/%=[1-（A样品-A空白）/（A对照-A空白）]×100
1.3.4 螯合金属离子能力的测定
参考Dinis等[14]的方法并有所改进。用去离子水配制质量浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的粗肽液，并以相应质量浓度的GSH和BHT为对照组。分别取1mL待测溶液加入0.05mL FeCl2（2mmol/L）中，混匀后加入0.2mL Ferrozine（5mmol/L）试剂启动反应，将混合物剧烈摇动混匀后于室温下静置10min，于562nm波长处测定溶液的吸光度。对照管以去离子水代替样品，待测物抑制Ferrozine-Fe2+复合物形成的百分率通过下式计算：
亚铁离子螯合率/% = [（A对照-A样品）/A对照]×100
1.3.5 多肽抑制亚油酸体系中脂质过氧化能力的评价方法
参考Qian等[15]的方法，用去离子水配制质量浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL的肽液，并以相应浓度的GSH和BHT为对照组。取2mL样品，加入0.5mL无水乙醇溶液，2.5mL亚油酸乳化液（0.02mol/L，pH7.0），2mL磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.0）。亚油酸乳化液的配制：0.2804g亚油酸，0.02804g吐温-20，用磷酸盐缓冲液定容至50mL。将溶液密闭后放在暗处并保持10min。空白对照以去离子水和无水乙醇代替样品、GSH和BHT。
过氧化值的测定采用硫氰酸铁法：取0.1mL亚油酸混合溶液，依次加入4.7mL 75%乙醇溶液和0.1mL 30%硫氰酸铵，再加入0.1mL 0.02mol/L已溶于3.5%盐酸中的FeCl2快速混匀，准确反应 3min后，在500nm波长处测吸光度。0时刻测定的OD值计为A0，以后每隔24h测定一次，OD值计为At，样品的抗氧化能力以144h时氧化抑制率表示。抑制率按下式计算：
抑制率/%=[1-（A样，144h-A样，0h）] /（ A空，144h-A空，0h）×100
1.3.6 对蛋白质氧化影响的测定
蛋白质氧化的测定参考Kwon等[16]的方法，略作修改。用磷酸盐缓冲液配置一定质量浓度的牛血清蛋白标准液，以20mg/mL的2，2'-偶氮二异丁基脒（AAPH）作为氧化剂氧化牛血清蛋白，构建蛋白质氧化体系，并以不同质量浓度的金华火腿粗肽液、BHT和GSH为抗氧化剂，以不加抗氧化剂组为阳性对照组，将每组分别混合后，在37℃孵育24h后，用0.02%的BHT加入混合液终止反应。样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行验证。
2 结果与分析
2.1 金华火腿粗肽液清除・OH的能力
羟自由基（・OH）是最活跃的一种活性分子，也是进攻性最强的化学物质之一，几乎可以与所有的生物分子、有机物或无机物发生各种不同类型的化学反应，并伴有非常高的反应速率常数和负电荷的亲电性，其半衰期约为10-9s。羟自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，使细胞坏死或突变，羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关[17]。因此，清除・OH将对人体防御各种疾病有重要意义[18]。如图1所示，随着浓度的增加，金华火腿粗肽液、BHT和GSH清除・OH的能力都显著增加（P
2.2 金华火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力
由图2可以看出：金华火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力显著高于GSH，但低于BHT（P
2.3 金华火腿粗肽液螯合Fe2+的能力
从已有的研究的数据来看，体内铁离子水平的增加会增加患各种慢性疾病的风险，如心血管疾病、癌症以及一些神经性疾病[19-20]。铁离子会导致体内活性氧的增加，而这些活性氧物质会导致DNA和脂质的破坏。此外，铁离子是一些自由基产生的前体，这些自由基导致的DNA损伤更有利于癌症和癌症细胞的增殖。Babbs[21]和Nelson[22]提出肠道暴露在铁离子中可能是一些发达国家以及肉类消费量高的地方人类患结肠癌的主要原因。关于活性氧和金属离子诱导的信号通路如图3所示。而短肽中暴露的中性和酸性氨基酸，其含有的游离氨基和羧基可以螯合金属离子，以抑制由金属离子产生的自由基。从图4可以看到：金华火腿粗肽液螯合铁离子的能力显著大于BHT和GSH（P
2.4 金华火腿粗肽液抑制脂质过氧化的能力
由图5可以看出：金华火腿粗肽液、GSH和BHT抑制脂质过氧化的能力随质量浓度增加呈上升趋势。当质量浓度小于4mg/mL时，金华火腿粗肽液抑制脂质过氧化的能力显著小于GSH和BHT，但当质量浓度达到4mg/mL时，三者之间差异不显著。金华火腿粗肽液抑制脂质过氧化的能力在质量浓度为5mg/mL时，达到46.7%。前人研究表明，含有 5～16个氨基酸的肽段能更好地抑制亚油酸的过氧化[23]。表明金华火腿中粗肽液中可能含有较多含有5～16个氨基酸的肽段，因而能很好很好地螯合脂质过氧化产生的自由基，而GSH肽链较短，亲水性增强，因而不能螯合脂质过氧化产生的自由基[24]。
2.5 金华火腿粗肽液对蛋白质氧化的影响
研究表明：体内大分子物质氧化产物的聚集是引起体内很多变化的主要原因。细胞蛋白质的氧化会产生很多疾病。一些蛋白质的氨基酸残基稳定性很差，极容易受到活性氧类物质的攻击而发生不同程度的氧化。AAPH是一种水溶性的氧化引发剂，在人体适宜温度条件下，它会分解产生烷基自由基，而后很快与氧气反应生成烷基过氧化自由基[25]，进而进攻蛋白质和DNA。各种抗氧化物质对由AAPH引起的牛血清蛋白氧化的抑制情况如图6所示。金华火腿粗肽液对于蛋白质氧化有一定的抑制作用，并且随着质量浓度的增加，抑制作用随之增强。当质量浓度达到5mg/mL时，可以大幅抑制牛血清蛋白的氧化。而GSH和BHT基本可以完全抑制蛋白质氧化。
3 结 论
金华火腿粗肽液的抗氧化活性随着质量浓度的增加而增加，清除自由基能力与GSH和BHT相当，螯合Fe2+能力显著高于BHT和GSH，并具有一定程度抑制脂质过氧化和蛋白质氧化的能力。金华火腿生产过程中产生大量肽段，这些肽段强大的抗氧化能力能够在一定程度上抵消火腿本身食盐含量高的不利影响。
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