HPLC—DAD测定人参首乌胶囊中8种人参皂苷类成分

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摘要 目的：建立同时测定人参首乌胶囊中8种人参皂苷类成分含量的hplc-dad方法。方法：采用Ultimate C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-水，梯度洗脱，流速1 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长203 nm。结果：人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd，20（S）-Rg3分别在0.242～12.1，0.222～11.1，0.251～25.1，0.245～24.5，0.232～23.2，0.232～23.2，0.264～26.4，0.244～24.4 μg成良好的线性关系，平均回收率分别为102.7%，103.2%，101.6%，101.2%，102.0%，100.7%，101.9%，102.0%。结论：该方法简便，准确，分离效果好，无干扰，可用于人参首乌胶囊中上述8种成分的含量测定。

关键词 人参首乌胶囊；人参皂苷；HPLC；含量测定

收稿日期 2013-03-08

基金项目 国家药品标准提高暨2015版药典科研项目；国家“十二五”支撑计划项目（2011BAI03B01）

通信作者 *冯伟红，副研究员，主要研究方向为中药质量分析，E-mail：；*王智民，研究员，研究方向为中药化学与质量控制，E-mail：

作者简介 吉丽娜，硕士研究生，E-mail： 人参首乌胶囊是由红参和制何首乌2味中药组成的复方制剂，具有益气养血的功效，临床上用于治疗气血两虚所致的须发早白、健忘失眠、食欲不振、体疲乏力等[1]。2010年版《中国药典》一部人参首乌胶囊的含量测定项下中仅以2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷作为该制剂中制何首乌的质量评价指标，文献报道中也曾有人采用荧光分光光度法[2]和RP-HPLC[3]对臣药制何首乌中的蒽醌类成分进行测定。红参作为该制剂处方组成中的君药，又为贵重药材，在文献报道中也仅是测定了人参皂苷Rg11个成分[4]，在药典标准中并未有相应的质量标准对君药红参的质量进行控制，因而无法体现中医药整体作用的特点。

本研究采用HPLC-DAD，建立了人参首乌胶囊中人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd，20（S）-Rg3等8种成分的同步含量测定方法，实现了对该制剂中红参的质量控制。结果表明该方法良好，可为2015年版《中国药典》中人参首乌胶囊质量标准的修订提供参考。

1 材料

Shimadzu LC 20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT溶液传输单元，SIL-20A自动进样器，SPD-M20A二极管阵列检测器，CTO-10AS柱温箱，LC Solution色谱工作站（日本岛津公司）； KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），功率250 W，工作频率40 kHz；XS205型1/10万天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；Milli-Q A10 纯水机（美国密理博公司）。

人参皂苷Rg1（批号110703-201027）、人参皂苷Re（批号110754-200822）、人参皂苷Rb1（批号110704-200420）、人参皂苷Rb2（批号111715-200802）、人参皂苷Rb3（批号111686-201002）对照品均购自中国食品药品检定研究院，规格为供含量测定用；人参皂苷Rc（批号R-008-120628）、人参皂苷Rd（批号R-009-120826）和20（S）-人参皂苷Rg3（批号R-010-120506）对照品购自瑞芬思生物科技有限公司，经面积归一化法测定，纯度均大于98%；乙腈、甲醇（HPLC级，美国Fisher公司），超纯水由Milli-Q A10纯水机制备。

人参首乌胶囊，郑州韩都药业集团有限公司，批号分别为110227，120202，120731。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 UltimateC18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），线性梯度洗脱，0～20 min，21%A，20～30 min，21%～23%A，30～35 min，23%～27%A，35～90 min，27%～2%A，90～100 min，32%～42%A，100～110 min，42%～48%A，流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长203 nm。理论塔板数按人参皂苷Rb1的峰计算应不低于6 000。对照品、供试品和缺红参阴性供试品的HPLC图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 取对照品人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd和20（S）-人参皂苷Rg3适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含上述成分0.483，0.444，0.502，0.490，0.464，0.464，0.529，0.488 mg的混合对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取人参首乌胶囊内容物粉末（过40目筛）约2.0 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取30 min，取出，放至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。取续滤液25 mL，减压蒸干，用甲醇5 mL溶解并定容，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 按照人参首乌胶囊处方比例和制备工艺制备缺红参的阴性样品，按 2.2项下方法制备阴性供试品溶液。

2.5 线性关系考察 取上述混合对照品溶液，分别进样1，2，5，10，15，20，25，50 μL，测定各种人参皂苷的峰面积。以测得的峰面积和被测物的进样量（μg），用最小二乘法进行线性回归，得到各个成分的回归方程以及线性范围，结果见表1。

1. 人参皂苷Rg1；2. 人参皂苷Re；3. 人参皂苷Rf；4. 人参皂苷Rb1；5. 人参皂苷Rc；6. 人参皂苷Rb2；7. 人参皂苷Rb3；8. 人参皂苷Rd；9. 20（S）-人参皂苷Rg3。

图1 混合对照品（A）、人参首乌胶囊供试品（B）和缺红参阴性供试品（C）的HPLC图

Fig.1 Chromatograms of reference substances（A）， Renshenshouwu capsule sample（B） and negative sample（C）

表1 人参皂苷类成分的线性方程和范围

Table 1 Regression equations and ranges of eight ginsenosides

2.6 精密度试验 取2.3项下的人参皂苷混合对照品溶液，于同1日内连续进样6次，每次进样10 μL，测定人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd和20（S）-人参皂苷Rg3的峰面积，其RSD分别为0.89%，0.90%，0.36%，0.24%，0.73%，0.22%，0.65%，0.87%，表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同批人参首乌胶囊（批号120731）供试品溶液，分别于供试品溶液制备后第0，3，6，9，12，15，24 h进样，测定人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd和20（S）-人参皂苷Rg3的峰面积，其RSD分别为1.9%，1.8%，1.7%，1.6%，1.8%，1.7%，1.7%，1.2%，表明供试品溶液的稳定性良好。

2.8 重复性试验 取同批人参首乌胶囊（批号120731）内容物，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，测定各成分峰面积，计算含量及其RSD。测得Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd和20（S）-人参皂苷Rg3的质量分数分别为1.56，2.80，0.480，0.750，0.780，0.510，1.81，0.610 mg·g-1；其RSD分别为1.4%，2.2%，2.3%，2.9%，2.8%，2.3%，1.8%，0.70%，表明该方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取同批人参首乌胶囊（批号120731）内容物约1.0 g，精密称定，分别按供试品含量-对照品量大致1∶1的比例加入一定量的对照品溶液，按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，测定人参皂苷各成分的峰面积，计算加样回收率及RSD，结果见表2。

表2 人参首乌胶囊中8种人参皂苷类成分的加样回收率

Table 2 Recoveries rate of eight ginsenosides

续表22.10 样品的测定 分别取不同批号的人参首乌胶囊3批，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液（n=2），精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，测定人参皂苷的峰面积，计算各成分的含量，结果见表3。

表3 人参首乌胶囊中人参皂苷类成分的质量分数

Table 3 The contents of eight ginsenosides in Renshenshouwu capsulesmg·g-1

3 讨论

本试验中分别考察了不同提取溶媒（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、水、正丁醇）、溶媒用量（30，50，70 mL）、提取方式（超声法、回流法、冷浸法）、提取时间（20，30，45 min）对人参皂苷含量的影响，结果表明以甲醇为提取溶媒超声提取的效率最高，超声提取30 min各组分均可达到平衡。

调研发现，人参皂苷类成分在色谱分离中存在分离度差、柱选择性强、重现性差等特点，长期以来一直是困扰广大色谱工作者的一个棘手问题。针对这些情况，在试验中曾先后对Ultimate C18，Hypersil GOLD C18，Spursil C18，Syncronis C18，Symmetry C18，Diamonsil C18（2），Accursil C18，Welchrom C18，Luna C18等不同填料的色谱柱进行了考察，结果发现，在本文确定的色谱条件下，Ultimate C18，Hypersil GOLD C18，Spursil C18等3种色谱柱对人参首乌胶囊中8种人参皂苷类成分实现了基线分离且分离时间相对较短，因此在进行人参类中药及其制剂的质量标准研究时，建议使用上述3种填料色谱柱。

药监局批准的人参首乌胶囊生产企业有16个，但是目前市场上能收集到的仅有郑州韩都药业集团有限公司一家产品，本研究的含量测定结果表明，即使是同一生产企业的产品，人参皂苷的含量依然存在较大差异。由于人参首乌胶囊的制备工艺中红参是以干粉直接压片入药，因此含量差异的来源主要是原料药（如产地及生长期等）及产品放置时间。因此只有从源头上全面控制红参药材及饮片的质量，制定切实可行的成品质量标准才能保证该制剂的质量。

[参考文献]

[1] 中国药典. 一部[S]. 2010：439.

[2] 刘丹华，吴巧凤. 荧光分光光度法测定何首乌及人参首乌胶囊中总蒽醌的含量[J]. 药物分析杂志，2007，27（10）：1636.

[3] 吴巧凤，文欣欣，余陈欢，等. RP-HPLC法测定制首乌和人参首乌胶囊中大黄素的含量[J]. 中华中医药学刊，2009，27（9）：1816.

[4] 易运辉. 人参首乌胶囊中人参皂苷Rg1的含量测定[J]. 中国实用医药，2008，3（25）：40.

Determination of eight ginsenosides in Renshenshouwu capsules by HPLC-DAD

JI Li-na， FENG Wei-hong， WANG Zhi-min， ZHU Jing-jing， ZHANG Qi-wei， CHEN Liang-mian， LI Chun（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China；

3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China）

[Abstract] Objective： To establish an HPLC-DAD method for simultaneous determination of eight ginsenosides in Renshenshouwu capsules. Method： Ultimate C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was adopted for gradient elution， with acetonitrile and water as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min-1， the column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelength was 203 nm. Result： A good linearity was observed in the range of 0.242-12.1， 0.222-11.1， 0.251-25.1， 0.245-24.5， 0.232-23.2， 0.232-23.2， 0.264-26.4， 0.244-24.4 μg for ginsenoside Rg1， Re， Rb1， Rc， Rb2， Rb3， Rd and 20（S）-ginsenoside Rg3， respectively， with the average recoveries of 102.7%， 103.2%， 101.6%， 101.2%， 102.0%， 100.7%， 101.9%， 102.0%， respectively. Conclusion： The method was so simple， accurate and effective that it could be used for quality control of the above eight components in Renshenshouwu capsules.

[Key words] Renshenshouwu capsules； ginsenoside； HPLC； content determination

doi：10.4268/cjcmm20131712