甲真菌病的3种实验诊断方法研究

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[摘要] 目的:探索一种操作简便、结果可靠的甲真菌病检验方法。方法:对121例拟诊甲真菌病的患者分别采用KOH直接镜检法和浸软法进行病损指、趾甲的真菌镜检,并与真菌培养法进行比较。结果:直接镜检法检出58例(47.90%),20% KOH溶甲法检出118例(97.52%),真菌培养法检出72例(59.50%)。结论:20% KOH浸软法真菌镜检是一种适合临床的、检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。

[关键词] 甲真菌病;镜检;培养

[中图分类号] R756.6[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)05(a)-029-02

Study of three laboratory tests for the diagnosis of onychomycosis

HU Jimei, ZENG Junrong, LIANG Haiyan, KUANG Jiaxi

(Clinical Laboratory, Conghua Central Hospital of Guangdong Province, Conghua 510900, China)

[Abstract] Objective: To find a simple, reliable and useful laboratory test for the diagnosis of onychomycosis. Methods: Nail samples from 121 clinically suspected cases of onychomycosis were screened by direct microscopic examination using potassium hydroxide (KOH) and KOH macerate pretreatment respectively, and compared withfungal culture. Results: Fungal elements were detected in 58 cases (47.90%) direct microscopic examination using KOH, 118 cases (97.52%) by KOH macerate pretreatment and 72 cases (59.50%) by fungal culture. Conclusion: Fungi microscopic examination using KOH macerate pretreatment is a reliable method that has high positive rate in the diagnosis of onychomycosis.

[Key words] Onychomycosis; Direct microscopy; Culture

甲真菌病(onychomycosis)是南方地区最常见的甲病,通常认为甲真菌病在人群中的发病率为3%～5%[1],占真菌病的20%～30%[2]。甲屑直接镜检和真菌培养是公认的诊断甲真菌病的“金标准”,但受取材的质和量等因素的影响,两者结合诊断的阳性率

1 资料与方法

1.1 一般资料

121例均为2006年9月～2009年10月来我院皮肤科门诊就诊的患者,入选患者均符合甲真菌病的诊断标准[6]。其中,男59例,女62例;年龄17～65岁,病程30 d～24年,平均4.2年。观察病甲数目432份,靶甲数目121份,伴手足癣38例,有甲板外伤史12例。受检前1个月内均未接受过局部和系统抗真菌药物治疗。

1.2 标本采集

以75%酒精消毒病甲表面后,用消毒手术刀刮弃表层甲屑,刮取和剪取拟诊为甲真菌病的靶甲及甲下碎屑,分为3份,其中,81份病甲标本取自远端侧缘甲下型,40份取自全甲毁损型。

1.3 方法及判断标准

刮取其病甲远端边缘和甲床皮屑进行传统的KOH直接镜检[6],同时剪取病损指、趾甲末端少许标本做浸软法真菌镜检和真菌培养。3份标本分别按下述3种方法处理:

1.3.1 直接镜检法取刮下甲屑于载玻片上,加10% KOH 1滴溶解,10 min后观察,Olympus光学显微镜下见菌丝和(或)孢子者为阳性。皮肤癣菌:菌丝较细、规则、分隔、分枝,可见关节孢子。酵母菌:可见酵母细胞团、芽生孢子及假菌系。真菌:菌丝粗大,不规则,可见特殊结构。

1.3.2 培养法采用两管法,即甲屑同时接种于含氯霉素和放线菌酮的沙氏培养基与含氯霉素、不含放线酮的沙氏培养基(以上培养基均为自制),每管最少接种3点,置25～27℃培养,随时观察培养情况。4周以上无菌落生长判定为阴性,有菌落生长者,皮肤癣菌及真菌的鉴定主要依据菌落形态、颜色等以及Olympus光学显微镜镜检鉴定,鉴定标准参照《医学真菌学――实验室检验指南》[7],念珠菌属用API20cAux试剂盒(法国BioMerieux公司)鉴定到种。

1.3.3 浸软镜检法将病甲标本置入20% KOH溶液中56℃ 40～50 min,待病甲标本完全浸透软化呈蛋白胨状,吸出多余的KOH液后,将标本放在载玻片上,用盖玻片轻轻将标本压平、压薄呈云雾状或毛玻璃状,在Olympus光学显微镜下见菌丝和(或)孢子者为阳性。皮肤癣菌:菌丝较细、规则、分隔、分枝,可见关节孢子。酵母菌:可见酵母细胞团、芽生孢子及假菌系。真菌:菌丝粗大,不规则,可见特殊结构。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件分析,行χ2检验,P

2 结果

2.1 直接镜检法结果

121例拟诊患者甲标本中,真菌阳性者58例(47.9%)。

2.2 培养法结果

121例拟诊患者甲标本培养出72例(59.50%)共80株真菌,单一感染69例(95.83%),混合感染3例(4.17%)。菌种分布情况见表1。

表1121例甲真菌病真菌培养结果

Tab.1The results of 121 onychomycosis by fungal culture

2.3 浸软镜检法

121例拟诊患者甲标本中,118例(97.52%)检出真菌成分,检查结果:孢子、菌丝形态初步提示为皮肤癣菌110例(91%),初步提示为酵母菌36例(30%),初步提示为真菌48例(38%)。其中2种或2种以上真菌混合24例。

3种方法检出结果见表2。

表2121例疑甲真菌病3种方法检查结果[n(%)]

Tab.2The results of 121 onychomycosis by three tests [n(%)]

三种方法检出率差异有高度统计学意义(χ2=75.247,P0.05)。浸软法镜检检出率高于直接镜检法,两者比较,差异有高度统计学意义(χ2=51.829,P

3 讨论

甲真菌病指甲板、甲床和甲周围组织的真菌感染,国内发病率约为15.6%[8],是皮肤科常见病、多发病,但误诊、漏诊患者时有发生,在系统治疗前,采用切实可行的诊断方法证实甲真菌感染十分重要。笔者采用直接镜检法、真菌培养及浸软镜检法进行了对比研究,结果显示,浸软镜检法明显高于直接镜检法和真菌培养,与文献报道一致。

虽然传统的KOH直接镜检法和真菌培养操作简单,但阳性率较低,分别为50%～75%和25%～80%[9],容易出现假阴性;组织病理法阳性率为99.44%[10],但要求条件高、操作复杂、时间长。直接镜检检出率较低,本研究中直接镜检检出58例(47.9%),但该方法快速、方便,可直接明确有无真菌感染。真菌培养虽为诊断甲真菌病的“金标准”,但是由于无活性休眠菌丝及甲标本暴露于空气中,污染机会较多,影响结果的准确性,造成培养阳性率低。培养法耗时虽较长,但可鉴定菌种,进行药敏试验对药物的选择有一定的指导意义,如克柔念珠菌对氟康唑天然耐药。组织病理法阳性率高于直接镜检和培养法,能观察到真菌在甲中寄生的状况,可对病原菌作出初步分类,并可对银屑病等病甲明确诊断,但要求条件高、操作复杂、时间长,因真菌在病甲内分布稀疏不均,往往需要多层面切片寻找方可避免假阴性结果,镜下菌体往往呈横断面或节段状,还需特殊染色(PAS染色)方易区别,甲切片对切片刀磨损大,制片过程需1周,对实验人员的实验组织病理学技术要求较高,使该法推广受限。浸软法真菌镜检与甲组织病理法比较,具有患者无痛苦、操作简便、经济、快速、镜下病甲内的真菌生长形态完整、无需特殊染色、低倍镜下即可观察到病甲内原始状分布的菌丝或关节菌丝的特点。张文娟等[11]提出应用KONCPA法诊断甲真菌病,笔者对此法进行了研究,20% KOH浸软镜检法是一种检出率高、可行性强的甲真菌病诊断方法。结果提示,组织病理学检查和20% KOH溶甲法可弥补甲真菌病诊断中真菌直接镜检和真菌培养法的不足,显著提高诊断阳性率和准确率。该法较甲病理法[9]诊断甲真菌病简便、快速,易于操作,门诊患者可无需固定步骤,制作湿片即可行镜下观察出报告,完成1份标本所需时间为1 h左右,在日益繁忙的皮肤性病科门诊中具有推广价值,建议临床推广应用。

[参考文献]

[1]余进,李若瑜.国内甲真菌病病原学的流行病学调查[J].中国真菌学杂志,2006,1(1):63-64.

[2]Haneke E, Roseeuw D. The scope of onychomycosis: epidemiology and clinical feature [J]. Int J Dermatol,1999,38(Suppl 2):7-12.

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[4]牛云彤,李少平.甲真菌病的诊断[J].中国麻风皮肤病杂志,2004,20(1):57-58.

[5]李筱芳,田伟,王红,等.多重PCR快速诊断甲真菌病[J].国际皮肤性病学杂志,2007,33(4):197.

[6]王光超.皮肤病及性病学[M].北京:科学出版社,2002:264.

[7]王端礼.医学真菌学――实验室检验指南[M].北京:人民卫生出版社,2005:137-289.

[8]中华医学会皮肤病学分会.皮肤科就诊患者足病情况调查[J].中华皮肤科杂志,2000,33(1):55.

[9]张文娟,蔡永明,桑,等.甲真菌病组织病理学检查及其意义[J].中华皮肤科杂志,1996,29(5):352-353.

[10]Liu HN, Lee DD, Wong C, et al. A new method for diagnosing tinea unguium [J]. Dermatology,1993,18(7):166.

[11]张文娟,蔡永明,桑,等.改良KONCPA法诊断甲真菌病的研究[J].中华医学检验杂志,1997,20(4):254.

(收稿日期:2010-03-01)