骨及钙化组织切片的复方脱钙液的配制及脱钙方法
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[中图分类号]R816.8 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）09（c）-116-01
骨及钙化组织非常坚硬，将其制成几微米薄切片难度较大。常用的方法是先脱钙，使组织变软后再切片，所以脱钙是非常关键的技术。目前使用的脱钙剂多为无机强酸类制剂，虽脱钙效果较好，但常造成组织形态，特别是细胞结构的破坏，影响骨组织形态观察和研究。为此，我们使用复方脱钙液脱钙，不仅能够保持组织形态良好，亦能用于特殊染色及切片，现介绍如下：
1 材料
临床医学生对狗行外科手术后，取胫骨分别锯成1 cm长，再沿胫骨纵向劈成四段。用生理盐水或0.1 mol/L的PBS(pH7.2~7.4)缓冲液洗2次，然后入3%戊二醛和4%多聚甲醛1:1混合液固定4 h；SHARP3A65型微波炉(日本，最大功率850 W，分5档可调)。
复方脱钙液：盐酸8 ml，醋酸5 ml和水杨酸10 g；依次加入蒸馏水87 ml中混合，配制成复方脱钙液。
2 方法
2.1 脱钙方法
将装标本的塑料提篮放在中型平底烧杯内加入复方脱钙液，再将其放入装有冰水的大平底烧杯或微波炉专用的塑料容器内，入微波炉2档10 min，取出更换经冰水制冷的脱钙液及吸热用的冷水，置炉内继续重复进行。判断脱钙情况，决定是否再次重复，操作致脱钙完成。脱钙过程中要随时检测脱钙液温度以不超过40℃为宜，并视情况更换脱钙液和检查脱钙程度。该法是众多加速脱钙法中效果最显著，应用最多的方法[1]。
2.2 脱钙终点判定
脱钙完成即应终止，以免脱钙过度，造成不应有的损伤。脱钙未完成即终止，脱钙不净在切片时标本破碎，影响切片质量。因此，如何判定脱钙终点很重要。从理论上讲，脱钙终点的测定方法有物理、化学及X线照相技术等。在实际工作中我们常采用针刺法，该法简单方便，易于掌握，唯其用于刺戳之针应采用针灸用体针为宜。凡体针能顺利刺入骨组织则可以顺利切片。
2.5 脱钙后改良除酸处理[2]
骨及钙化组织脱钙后再除酸是石蜡切片有的过程，也是HE染色中的不足之处。我们在实际工作中体会到，应用2%氢氧化钠溶液处理10 min，再用流水洗涤10 min，就可完成整个除酸过程，并且具有以下优点：(1)由于2%氢氧化钠溶液是一种强碱稀溶液，能很快渗入到组织细胞中中和酸，大大缩短了流水洗涤时间。传统用5%硫酸钠浸渍过夜，再用流水洗涤24 h，这种除酸方法时间长达36~48 h，而改良法除酸只需20 min即可完成除酸过程。(2)经此改良除酸制成的切片对苏木素嗜染性强、效果稳定、操作方便、易于掌握。染片保存数年后复检，并无褪色现象，有利于存档或回顾性研究。
2.6 切片及染色
将常规脱水、浸蜡、包埋的骨组织用锋利C型组织切片刀切成5 μm切片，直接贴附在干净载玻片上；切片置于0.1%~0.5%氢氧化钠水溶液中1 min，脱酸；滤纸吸干，将切片入100%甲醇50 ml固定液中固定1 min。充分水洗，常规HE染色，镜检。
3 结果
标本用复方脱钙液经微波炉脱钙处理后切片质量及效果明显优于传统方法，所制成的切片，经常规HE染色，骨组织结构保持完整，镜下结构清晰。细胞核呈不同程度紫蓝色，鲜艳、清晰、对比度强、长期保存不褪色。
4 讨论
复方脱钙液能使骨组织中难溶于水的羟磷灰石快速转化为易溶于水的酸式磷酸盐，氯化钙等使标本软化。复方脱钙液中的水杨酸经加温后可松懈胶原，促进脂肪溶解等。胶原松懈有利于钙离子的析出，脂肪溶解可使组织孔疏通有利于脱钙、固定、脱水和浸蜡。微波辐射可加速组织内部分子高速运动，加速脱钙速度，因标本在酸性溶液中滞留时间短，对染色结果无影响。
微波脱钙过程中要不断更换脱钙液，一方面防止温度太高，另一方面可将脱掉的钙盐弃掉，加新液以增加脱钙强度。脱钙温度一般不超过40℃，温度愈高脱钙愈快，影响愈严重，轻者可引起组织肿胀，光镜染色不良，重者可导致组织结构严重破坏，软化甚至溶解。脱钙时间长，超微结构也会有一定程度的损伤[3]。
固定标本是非常重要的第一步，标本不新鲜，固定的不及时、不充分，很难取得好的结果。常规浸泡固定法中固定液不易很快浸透到坚硬致密的骨和钙化组织内，故人体标本宜先取材后固定，实验动物标本最好采取血管灌注固定。不提倡固定与脱钙同步进行，后者对组织的损伤较先固定后脱钙的明显，不固定即脱钙会引起组织破坏。
脱钙液的用量要充足，最好为标本体积的30~50倍，并及时更换脱钙液；利用微波辐射加速脱钙时，注意不能用金属容器，防止打火及微波泄漏伤人，容器要大并加盖，避免脱钙液溢出损害仪器设备。
[参考文献]
[1]申姜颖,李伟,黄庆玉,等.微波辐射下螯合剂技术与骨大切片制作中的应用[J].中华病理学杂志,2000,29(6):136-137.
[2]王爽,曾汉英,杨淑艳.骨组织脱钙后除酸方法的改进[J].第四军医大学吉林军医学院学报,2003,25(2):86.
[3]杨传红,赖晃文,唐赓云,等.微波快速脱钙及其脱钙液的选择[J].临床与实验病理学杂志,1996,12(4):357-358.
（收稿日期：2008-02-26）