大孔吸附树脂分离纯化冬凌草甲素条件的优化
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摘要：比较了大孔吸附树脂D-101、DM-130、AB-8和NKA-9对冬凌草甲素的吸附和解吸附能力。结果表明，AB-8树脂对冬凌草甲素具有较好的吸附分离性能。其最佳分离纯化工艺条件为，吸附时进料浓度0.486 mg/mL、流速2 BV/h、进样量4 BV；解吸附时体积分数80%的乙醇溶液作洗脱剂、流速1.5 BV/h、洗脱剂用量3 BV。经AB-8树脂吸附与解吸附后，冬凌草甲素回收率为78.4%；用甲醇重结晶后纯度达到99.5%，回收率为54.3%。
关键词：大孔吸附树脂；冬凌草甲素；分离纯化；吸附；解吸附
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4201-04
Optimization of Separation and Purification Conditions of Rubescensine A by Macroporous Adsorption Resin
YE Hong-yong，ZUO Guang-ling，LI Ru-lin
（Department of Biological and Chemical Engineering， Nanyang Institute of Technology， Nanyang 473004， Henan，China）
Abstract： The adsorption and desorption capacities of four kinds of macroporous adsorption resins， D-101， DM-130， AB-8 and NKA-9 were compared. The results showed that AB-8 resin had the best adsorption and desorption capability. And the optimum technology parameters for adsorption were feeding concentration 0.486 mg/mL， flow rate 2 BV/h and feeding volume 4 BV； for desorption were 80%（volume fraction） alcohol as elution solvent， flow rate 1.5 BV/h and elution volume 3 BV. After treated with AB-8， the yield of rubescensine A was 78.4%. And the purity of rubescensine A could be up to 99.5% if recrystallized by methanol， and the yield was 54.3%.
Key words： macroporous adsorption resin； rubescensine A； separation and purification； adsorption； desorption
收稿日期：2012-09-13
基金项目：河南省重点科技攻关项目（122102210481）
作者简介：叶红勇（1978-），男，河南南阳人，讲师，硕士，主要从事天然产物活性成分的提取研究，（电话）0377-62076316（电子信箱）
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冬凌草（Isodon rubescens）又名碎米桠，为唇形科香茶属多年生小灌木植物，广泛分布于我国中部和南部，主产于河南太行山南麓济源、焦作、鹤壁等地[1]。其主要成分二萜化合物冬凌草甲素（Rubescensine A）对肿瘤细胞有确切的杀伤、抑制增殖作用，主要用于治疗食管癌、乳腺癌、直肠癌及贲门癌等肿瘤疾病[2]。目前，冬凌草甲素主要通过乙醇（或乙醚）回流提取、萃取、脱色、硅胶柱层析分离和结晶等工艺生产。然而由于冬凌草甲素为热敏性成分，在回流提取时有效成分易发生变化[3，4]，而柱层析前的拌硅胶和装柱工序操作劳动强度大，工业化生产受到限制[5，6]。近年来，大孔吸附树脂被广泛用于中草药有效成分如黄酮[7]、多酚[8]、皂甙[9]等的分离富集以及中药制剂的生产，而超声波技术用于冬凌草甲素的提取可以避免高温对冬凌草甲素有效成分的破坏[10]。本研究采用超声波法提取冬凌草甲素，并进一步利用大孔吸附树脂进行富集，探讨了大孔吸附树脂分离纯化冬凌草甲素的最佳工艺条件和参数，为其开发应用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
冬凌草（HPLC法测定冬凌草甲素含量为0.623%）购自河南省济世药业有限公司，冬凌草甲素对照品（纯度>99.9%）由河南省生物研究所提供。D-101、DM-130、AB-8和NKA-9树脂（天津市海光化工有限公司），玻璃层析柱（φ26 mm×600 mm，上海安澜德生物科技有限公司），Prominence LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AL104型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）公司）。
1.2 冬凌草甲素提取液的制备
采用超声波法提取冬凌草甲素，冬凌草干燥粉碎后过60目筛，准确称取100 g冬凌草粉末，每次加入800 mL 95%（体积分数，下同）的乙醇，在500 W功率下超声波提取3次，每次30 min，合并提取液，再加入30 g活性炭，超声波脱色2次，每次15 min，滤液减压浓缩至膏状，用40%的乙醇在1 000 mL容量瓶中定容，HPLC法测得冬凌草甲素初始浓度C0为0.486 mg/mL。
1.3 分析方法
1.3.1 色谱分析条件 Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃，检测波长240 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，流动相为体积分数60%的甲醇溶液。
1.3.2 标准曲线的绘制 精确称取10 mg冬凌草甲素对照品置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，作为对照品储备液。取对照品储备液配制36、59、98、121、162、198 μg/mL的系列对照品溶液。分别取10 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=6 073.43X-3.36，r=0.999 8，表明冬凌草甲素在36～198 μg/mL范围内浓度与峰面积线性关系良好。
1.4 树脂的预处理
树脂先用95%的乙醇浸泡溶胀24 h，湿法装柱，用95%的乙醇洗脱至流出液加5倍水不出现白色浑浊为止。去离子水洗尽乙醇，再用4倍树脂体积的5%盐酸浸泡2 h，去离子水洗至中性；再用50 mg/L氢氧化钠浸泡2 h后用去离子水洗至中性，备用。
1.5 静态吸附解吸附试验
分别精确称取0.5 g 4种干树脂置于150 mL具塞锥形瓶中，再分别加入50 mL冬凌草甲素样品溶液。25 ℃、110 r/min恒温振荡至吸附平衡（约12 h），利用HPLC法测定并计算各样品溶液中冬凌草甲素的平衡浓度；离心除去冬凌草甲素溶液后，加入50 mL 80%的乙醇溶液，25 ℃、110 r/min恒温振荡12 h，测定洗脱液中冬凌草甲素的浓度，按下列公式计算各项指标：
Qe=■；
E=■×100%；
D=■×100%；
R=■×100%
式中，Qe为树脂的平衡吸附量，mg/g；V1为冬凌草甲素样品溶液体积，mL；C0为冬凌草甲素样品溶液起始浓度，0.486 mg/mL；Ce为样品溶液中冬凌草甲素的平衡浓度，mg/mL；m为干树脂的质量，g；E为树脂的吸附率，%；D为树脂的解吸率，%；V2为解吸时加入的乙醇溶液体积，mL；C1为洗脱液中冬凌草甲素的浓度，mg/mL；R为冬凌草甲素的回收率，11%。
1.6 动态吸附和洗脱试验
室温下，冬凌草甲素样品溶液以一定的流速通过装有预处理后的树脂的层析柱，测定流出液中冬凌草甲素的浓度，考察吸附液流速和进料浓度对树脂吸附性能的影响，绘制泄漏曲线，确定树脂的最佳吸附工艺条件。对已吸附冬凌草甲素的树脂用乙醇溶液进行解吸附试验，考察洗脱剂流速对树脂解吸附性能的影响，并绘制解吸曲线，确定最佳洗脱液流速。
2 结果与分析
2.1 静态吸附解吸附特性
2.1.1 大孔吸附树脂的选择 冬凌草甲素属于弱极性化合物，根据类似物吸附类似物的原则，树脂的极性是影响其吸附性能的重要因素。为了筛选出适合用于冬凌草甲素吸附分离的树脂，对D-101、DM-130、AB-8和NKA-9 4种不同极性树脂的静态吸附解吸附性能进行了研究，结果见表1。从表1可以看出，随着树脂极性的增强，4种树脂的吸附率逐渐升高，而解吸率则逐渐下降，说明树脂极性越强对冬凌草甲素的吸附作用力越强，而解吸附时则越困难。综合评价各种树脂的吸附和解吸附性能，并结合回收率， AB-8树脂对冬凌草甲素的分离纯化效果最好，故选用AB-8树脂对冬凌草甲素的分离纯化工艺作进一步研究。
2.1.2 树脂的吸附等温曲线 称取AB-8树脂0.5 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL不同初始浓度的冬凌草甲素溶液，测定AB-8树脂分别在25、35和55 ℃下的平衡吸附浓度Ce，以Ce和Qe分别为横、纵坐标绘制曲线，结果如图1所示。由图1可知，在25～55 ℃范围内平衡浓度相同时，AB-8树脂的吸附量随温度下降而升高，可判断冬凌草甲素在AB-8树脂上的吸附为放热过程，降低温度可以促进AB-8树脂对冬凌草甲素的吸附。因此，本试验选取吸附温度为25 ℃。
2.1.3 树脂的静态吸附动力学曲线 精确称取1.0 g AB-8干树脂置于150 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL冬凌草甲素乙醇初始溶液，在25 ℃、110 r/min恒温振荡。间隔一定时间取3 mL（V0）上清液测定冬凌草甲素浓度（Ci），并计算吸附量（Q），经i次取样后，冬凌草甲素浓度（Ci）与吸附量（Q）的计算公式如下[11]：
Q=■
以吸附量Q为纵坐标、时间t为横坐标绘制AB-8树脂对冬凌草甲素的静态吸附动力学曲线如图2所示。由图2可以看出，在开始吸附的1.5 h内，吸附量升高很快，2 h后开始趋于平缓，3 h以后基本不再变化。说明AB-8树脂对冬凌草甲素的吸附在3 h内达到动态平衡，属于快速吸附平衡。
2.1.4 洗脱剂的选择 冬凌草甲素属于贝壳杉烯二萜类化合物，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂，考虑到乙醚的易燃性和甲醇的毒性，本试验选用乙醇溶液作为解吸剂。不同体积分数的乙醇溶液对冬凌草甲素的解吸附作用如图3所示。从图3可以看出，95%的乙醇作洗脱剂时冬凌草甲素的解吸率最大，达81.7%，且2 h内基本达到解吸附平衡。60%和70%的乙醇在4 h后解吸率都未能达到70.0%，解吸速率相对较慢。而80%的乙醇虽然解吸率没有95%的乙醇的大，但在2.5 h内解吸率达到了78.0%，考虑到分离提纯的经济性，本试验选用80%的乙醇作为洗脱剂。
2.2 动态吸附-解吸附特性
2.2.1 流速对泄漏曲线的影响 进料冬凌草甲素样品溶液浓度为0.486 mg/mL，分别以1、2、3、4 BV/h的流速进样，定时收集流出液，测定流出液中冬凌草甲素的浓度，并绘制泄漏曲线，结果如图4所示。由图4可知，流速较快时，流出液中冬凌草甲素浓度偏高，泄漏率也偏高。随着流速的减缓，AB-8树脂对冬凌草甲素的吸附率逐渐升高，这是因为流速低，树脂与样品的接触时间长，传质充分，吸附完全。但流速过小会导致生产效率降低，结合实际生产的需要，本试验选定流速为2 BV/h。另外，从图4还可以看出，在流速2 BV/h、进料体积约4.5 BV时，流出液浓度接近进料浓度的一半，出现严重的泄漏，因此进料体积以4 BV为宜。
2.2.2 进料浓度对泄漏曲线的影响 图5为2 BV/h流速时不同进料浓度的冬凌草甲素样品溶液的泄漏曲线。从图5中可以看出，进料浓度高时，吸附传质速度很高，吸附很快达到平衡。根据李坤平[12]的研究，吸附速度存在一个平衡值，吸附速度过快会造成AB-8树脂对冬凌草甲素的吸附率不高，而进料浓度过低时吸附达到平衡的时间则很长。综合吸附率和吸附时间两方面的因素，本试验选择进料浓度为0.486 mg/mL。
2.2.3 洗脱液流速对解吸附曲线的影响 用80%的乙醇溶液分别以1.0、1.5、2.0和2.5 BV/h的流速连续洗脱已经吸附相同量冬凌草甲素的AB-8树脂，解吸附曲线如图6所示。从图6可以看出，不同的洗脱速度对冬凌草甲素的洗脱效果有一定的影响，随着洗脱剂流速的减缓，洗脱剂洗脱强度逐渐增加，洗脱曲线也逐渐变窄，在实际分离过程中可以提高冬凌草甲素的分离效率。另外，在流速为1.0和1.5 BV/h时，洗脱峰的峰形和峰高没有太大的区别，而且流速为1.5 BV/h时只需3 BV的洗脱剂就可以将冬凌草甲素全部洗脱下来。考虑到缩短生产时间的需要，本试验选用1.5 BV/h的流速为洗脱速度。
2.2.4 验证试验结果 按照上述优化出的最佳动态吸附-解吸附工艺条件进行验证试验，重复3次，所得冬凌草甲素的平均回收率为78.4%。洗脱液经减压浓缩后加入适量甲醇热溶解，冷却后析出冬凌草甲素结晶，纯度为96.0%，重结晶后纯度可达到99.5%，此时回收率为54.3%。
3 小结与讨论
1）通过比较4种大孔吸附树脂对冬凌草甲素的静态吸附和解吸附性能，确定AB-8可以有效地分离纯化冬凌草甲素。动态吸附和解吸附试验表明，AB-8对冬凌草甲素的回收率为78.4%；用甲醇重结晶后冬凌草甲素纯度达到99.5%，回收率为54.3%。
2）AB-8树脂纯化冬凌草甲素的最佳工艺参数为吸附时进料浓度0.486 mg/mL、流速2 BV/h、进样量4 BV；解吸附时80%的乙醇溶液作洗脱剂、流速1.5 BV/h、洗脱剂用量3 BV。
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