HPLC―DAD同时测定香丹注射液中7种丹参酚酸类成分

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摘要：目的 采用高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定香丹注射液中7种丹参酚酸类成分。方法 采用Thermo ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈-0.05%磷酸水为流动相梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm。结果 丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹参酚酸B、丹参酚酸A在试验范围内线性关系良好（r2>0.999 0），精密度试验RSD

关键词：香丹注射液；高效液相色谱-二极管阵列检测法；丹参酚酸；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.12.021

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）12-0056-03

Simultaneous Determination of Seven Salvianolic Acids in Xiangdan Injection by hplc-dad MU Xiang-shan1， ZHANG Qiang1， FANG Xin-sheng2， WANG Jian-hua2， ZHANG Jin2 （1.Taian Hospital of TCM， Taian 271000， China；2.College of Agronomy， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract：Objective To determine the seven main salvianolic acids in Xiangdan injection by the developed HPLC-DAD. Methods The HPLC analysis was performed on a column of Thermo ODS2 （4.6 mm×250 mm， 5 ?m）. The mobile phase was acetonitrile and water with 0.05% phosphoric acid. Gradient elution was performed in linear gradient. The flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength was 280 nm. Results The calibration curves of Danshensu， protocatechualdehyde， caffeic acid， rosmarinic acid， lithospermic acid， salvianolic acid B and salvianolic acid A showed good linear regression （r2>0.999 0） in the investigated concentration ranges. The RSD of precision and the stability in 48 h was less than 1% and 2%， respectively. The average recoveries were between 98% and 103% with RSD

Key words：Xiangdan injection；HPLC-DAD；salvianolic acids；determination

香丹注射液由丹参和降香2味中药组成，临床主要用于心绞痛、心肌梗死等疾病的预防和治疗[1]。现代药理研究表明，香丹注射液具有改善血液流变学、抑制血小板聚集、显著降低脑缺血再灌注损伤、改善心肌缺血等作用[2-4]。香丹注射液的主要药效成分为来自丹参的水溶性酚酸类成分，如丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B等。目前部颁标准（WS3-B-3289-98）只对该制剂中原儿茶醛含量进行定量分析，对其他重要成分未制定质量标准[1]。丹参中的丹参素、原儿茶醛、丹参酚酸A、丹参酚酸B、迷迭香酸、紫草酸在治疗心脑血管疾病等方面都具有重要作用。因此，建立多成分分析方法可以进一步提高制剂质量。目前，已有文献对香丹注射液中的丹参素、丹参酚酸B等成分进行了含量测定[5-7]，但现有报道同时测定的成分少或分析时间长。因此，本试验采用高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD）同时测定香丹注射液中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹参酚酸A、丹参酚酸B、迷迭香酸、紫草酸7种活性成分的含量，为该制剂质量标准的提高提供参考。

通讯作者：房信胜，Tel：0538-8242226，E-mail：xinshf@126. com

1 仪器与试药

BD-25十万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司），包括Waters 600四元泵，在线真空脱气机，Waters 2996二极管阵列检测器（DAD），Empower2色谱工作站。

对照品丹参素钠（批号110855-200809）、原儿茶醛（批号110810-201007）、咖啡酸（批号110885-200102）、迷迭香酸（批号111871-201102）购自中国药品生物制品检定所，丹参酚酸A （批号11070105）、丹参酚酸B（批号11050908）、紫草酸（批号11092607）购自上海同田生物技术有限公司。香丹注射液（购自当地药店），分别为亚宝药业集团股份有限公司（批号100906）、江苏康宝制药有限公司（批号110201）、上海新亚药业高科有限公司（批号101115）产品。乙腈（色谱纯，天津克密欧化学试剂公司），水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Thermo ODS2（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）。梯度洗脱条件为：起始流动相13%A-87%B；15 min，23%A-77%B；30 min，25%A-75%B；35 min，60%A-40%B。流速1.0 mL/min，检测温度25 ℃，进样量20 ?L，检测波长280 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品丹参素钠10.00 mg、原儿茶醛13.80 mg、咖啡酸1.35 mg、丹酚酸B 13.00 mg、丹参酚酸A 6.30 mg、迷迭香酸5.00 mg、紫草酸5.50 mg，分别置5 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，作为单一成分的对照品溶液。精密吸取各对照品溶液适量，置10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取香丹注射液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，经0.22 ?m的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4 标准曲线的建立

按色谱条件，将系列浓度的混合对照品溶液依次进样20 ?L，测定。以各成分的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程，见表1。

表1 香丹注射液中7种成分的线性关系

成分 回归方程 线性范围（?g/mL） r2

丹参素 Y=1E+07X+12 288.00 200.00～2.00 0.999 3

原儿茶醛 Y=1E+08X+5 824.80 128.00～1.28 0.999 9

咖啡酸 Y=7E+07X-268.09 27.00～0.27 0.999 1

迷迭香酸 Y=4E+07X+3 946.90 100.00～1.00 0.999 8

紫草酸 Y=2E+07X+2 251.00 110.00～1.10 0.999 8

丹参酚酸B Y=2E+07X+10 316.00 260.00～2.60 0.999 9

丹参酚酸A Y=5E+07X+4 157.40 126.00～1.26 0.999 9

2.5 精密度试验

按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品混合溶液20 ?L，连续进样6次，计算各成分的峰面积。结果丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹参酚酸A的色谱峰峰面积的RSD分别为0.57%、0.28%、0.50%、0.37%、0.30%、0.44%、0.39%（n=6）。

2.6 稳定性试验

精密量取香丹注射液1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、6、12、24、36、48 h进样测定。结果样品中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹参酚酸A的色谱峰峰面积的RSD分别为1.39%、0.95%、1.20%、1.06%、1.33%、1.51%、1.16%（n=6）。

2.7 重复性试验

精密量取香丹注射液1 mL共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果样品中丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹参酚酸A的色谱峰峰面积的RSD分别为0.55%、0.59%、0.66%、0.73%、0.60%、0.82%、0.91%（n=6）。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的香丹注射液1 mL各3份，分别精密加入对照品适量，按供试品溶液的制备方法制备并测定，计算回收率，结果丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹参酚酸B、丹参酚酸A的平均回收率分别为100.2%、99.5%、100.4%、101.0%、101.9%、98.5%、103.0%，RSD分别为1.03%、1.05%、1.18%、1.60%、0.96%、1.77%、1.80%（n=3）。

2.9 样品含量测定

精密吸取香丹注射液各1 mL，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，根据标准曲线和峰面积计算样品中各成分的含量。共测定3个厂家生产的香丹注射液，结果见表2。色谱图见图1。

表2 7种成分在不同厂家香丹注射液中的含量（mg/mL）

成分 新亚高科 康宝制药 亚宝药业

丹参素 2.245 2.190 1.928

原儿茶醛 0.563 0.454 0.490

咖啡酸 0.010 0.009 0.006

迷迭香酸 0.117 0.081 0.051

紫草酸 0.094 0.073 0.032

丹参酚酸B 0.155 0.120 0.085

丹参酚酸A 0.260 0.192 0.203

A

B

注：A.对照品；B.供试品；1.丹参素；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；

4.迷迭香酸；5.紫草酸；6.丹参酚酸B；7.丹参酚酸A

图1 香丹注射液HPLC图

3 讨论

香丹注射液主要活性成分为来自丹参的酚酸类成分。丹参原材料中丹参酚酸B的含量最高，其次含有一定量的迷迭香酸、紫草酸以及少量的丹参素、丹参酚酸A等。在香丹注射液的制备工艺中，丹参经过提取、浓缩、分离、灭菌等高温高湿过程，化学性质不稳定的酚酸类成分会存在分解以及转化等情况。并且，不同的原材料以及生产工艺会导致产品中成分的含量差异大，直接影响临床疗效。在现有国家标准中，只对香丹注射液中的原儿茶醛进行了定量分析，应通过测定更多的成分或制定指纹图谱标准来进一步提高该产品的质量标准，以保证临床用药的安全性和有效性。

本研究建立了同时测定香丹注射液中7种成分的HPLC分析方法，结果表明：①按部颁标准规定的原儿茶醛的限量，各产品均符合要求；②不同厂家产品中同一成分的含量以及不同成分间的比例差异大；③原料丹参中含量最高的成分丹参酚酸B在注射液中含量很少，说明在制备过程中该成分大量分解；④原料丹参中含量较少的丹参素、原儿茶醛以及丹参酚酸A在香丹注射液中含量大幅增加，特别是丹参素和原儿茶醛已成为香丹注射液的重要活性成分。

丹参酚酸类成分水溶性强，极性大，采用反相高效液相色谱分离时，一般需采用较长分析时间才可能获得较好分离。本试验采用ODS2反相色谱柱，以乙腈-0.05%磷酸水为流动相，通过进一步优化色谱条件使待测成分在35 min内均达到基线分离，分析时间较短，节省溶剂，提高效率。采用DAD对检测波长进行了考察，结果表明，酚酸类化合物在280 nm处均呈现良好的紫外吸收，色谱信息最为丰富，故选用280 nm作为检测波长。

参考文献：

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