琼脂糖凝胶电泳的理论技术和应用
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摘 要：主要研究琼脂糖凝胶电泳的基本理论以及技术，并举例说明琼脂糖凝胶电泳在PCR产物的检测以及DNA制备等方面的应用。
关键词：琼脂糖凝胶 电泳技术 理论技术 应用
中图分类号：Q503
文献标识码：A
文章编号：1007-3973（2012）006-001-02
1 引言
琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离，这种技术时基因操作中常用的一种方法。下面简单介绍琼脂糖凝胶电泳的理论技术及其应用。
2 琼脂糖凝胶电泳技术及其原理
(1)电泳主要是指混悬于溶液中的样品电荷颗粒，在电场影响下向着与自身相反电荷的电极移动的现象，电泳技术是一种非常先进的检测手段，电泳技术与其它先进的技术相配合能够创造出非常之高的成果，这种技术能够使人们以最小的代价获得最大的利益。电泳技术现在主要用于纯化以及分离DN段的一种最常用的技术。
原理：电泳是现在用于纯化以及分离DN段的最常用的技术，如果装备一块“胶”包含电解质的多孔支持介质，并把这些介质放置在静电场中，DNA分子将会随着向阳极移动，这主要是因为DNA分子沿着双螺旋骨架两侧带有含有电荷的磷酸根残基，当DNA的长度增加后，来自电场的驱动力以及凝胶的阻力之间的比率就会降低，并且不同长度的DN段就会出现不同的迁移率，所以就可以根据DNA分子大小使其分离。这个过程可能是通过把分子量标准参照物或者是示踪燃料以及样品一起进行电泳检测分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DN段大小的标准。
(2)琼脂糖凝胶电泳主要是采用琼脂糖作为支持介质的电泳方法，琼脂糖凝胶电泳技术的分析原理与其他支持物电泳的最主要的区别是它具有“电泳”和“分子筛”双重作用。琼脂糖凝胶是一种网络结构，物质分子通过时会受到阻力，其中较大的分子物质在涌动时受到的阻力比较大，所以在凝胶中，带电颗粒的分离不仅与静电荷的性质以及数量有关，而且与废纸的大小有很大的关系，这就可以大大的提高了粪便能力，但是由于其孔径相差比较大，对于大多数蛋白质来说其分子筛效应很小，目前琼脂糖凝胶技术主要用于核酸的研究中。
核酸和蛋白质将会根据PH不同而具有不同的电荷，所以在电场中受力的大小也就不同，因此跑的速度不同，所以可以根据这种原理将其分离。电泳缓冲液的PH一般在PH6到PH9之间。离子强度在0.02到0.05之间最为合适，常用1%的琼脂糖作为电泳支持物，并且琼脂糖凝胶可以进行区分相差100bp的DN段，其中分辨率的分辨率虽然比聚丙烯酰胺凝胶低，但是它分离的范围非常广，并且制备非常容易，普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围在0.2到20Kb，利用脉冲电泳。可以分离高达10^7bp的DN段。
3 琼脂糖凝胶电泳分离DAN片段实验分析
3.1 实验原理
(1)DN段中具有PO43-基团，在pH7.5的Buffer中带负电，并且在电场中向正极进行移动。DN段中大小不同，电荷的密度也不同，在自由电泳时，各种核酸分子的迁移率是非常小的。(2)在实验的过程中选择适当密度的凝胶作为支持物，可以使其具有一定的孔径，这样就能充分发挥分子筛效应，从而可以使不同大小的核算片的迁移率有很大的差异，进而达到分离的作用。(3)DNA经过EB染色，EB可以插入DNA双螺旋结构中两个碱基的作用，并与核酸形成络合物。在紫外线的激发下可以产生橘黄色的荧光。标准的电泳能够通过EB染色之后可以观察到六条带。
3.2 试剂
TAE液，EB，电泳，1%琼脂糖。
3.3 方法
(1)连线：电泳仪的连接，正极（红色）—红色，负极（黑色）—黑色；(2)凝胶槽的准备：采用胶布进行固定凝胶槽的两端，并应该使梳子的高度调到距槽底2、3mm。(3)首先取出0.8g的琼脂糖，加入到80ml的TAE中，热浴溶解到透明状为最佳。然后在60℃左右时，添加100%eL的EB，然后倒入到凝胶槽中，在实验的过程中应该注意胶面的平整性，没有气泡。最后冷却之后拔去梳子。
3.4 加样
首先应该取出胶布，并将管号的胶板放在电泳槽中。然后加入电极Buffer，使其高出胶面的1~3mm。最后采用进样器进行吸取样品20%eL并加入到样品槽中。
3.5 电泳
V=100V，1-1.5h，至溴酚蓝移出2/3。
3.6 观察
在紫外灯下进行观察，并做好记录，可以看到DNA橙红色区带。
4 琼脂糖凝胶电泳技术的应用
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的技术主要是在具有一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与分子量常用的对比数成反比，并且分子的构型也和迁移量有一定的关系。并且如果琼脂糖凝胶的浓度过高时，凝胶孔径就会变小，就会导致环状的DNA不能进入胶中因此相对的迁移率就会变为0，如果同等大小的直线DNA可以根据长轴的方向迁移，其相对迁移率就会大于0。
4.1 适合分离大片段的DNA
在进行CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒提取食用菌DNA的实验中，实验研究人员主要采用CTAB法和CTAB与DNA凝胶回收试剂盒结合法两种方法进行实验提取DNA，通过实验进行实验研究表明CTAB与DNA结合法比CTAB法提取DNA样品的电泳条带更加清晰规则，并且DNA的酶切效率明显高于CTAB法，由此可以看出CTAB与DNA结合法能够高效的的富含多糖的材料中分离DNA。
4.2 可以提取大分子DNA
在“洋葱帕克霍尔德氏菌HMW·DNA的制备及酶切研究”的实验中说明大片段的基因组文库的关键主要是能够获得高分子量的基因组DNA，但是如果采用比较成熟的商品作为化学试剂盒进行提取基因组DNA，这种方式只能达到大约20Kb的DNA，但是酶抽提取法在制备的过程中需要多次进行抽取法才能提出比较纯净的DNA，并且这种提取方法很容易造成基因组的断裂，并且也很难得到比300Kb更加大的DNA组，在实验的过程中采用这两种方法都不能达到预期的目的。经过研究人员大量的实验以及研究发现，利用琼脂糖凝胶电泳技术制备成凝胶块进行提取基因组DNA不仅可以获得大片段的基因组DNA，而且得到的基因组DNA与粘粒基因组文库要求相符合的DNA，在研究的过程中研究人员主要采用普通熔点的琼脂糖制备的凝胶块进行制备基因组DNA。
4.3 PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳检测
在基因组DNA的提取中，DNA经卵育以及沉淀、抽取后然后采用70%的乙醇进行洗涤两次，然后再使用适量的双蒸水进行溶解DNA，接着在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以1Kb的DNAladder，作为参照，具体的检验方法主要是利用2.0%的琼脂糖制作成为凝胶，然后取出1微升的上样缓冲液和AFLP—PCR混匀后进行上样，用120V的电泳50分钟，1譚BF电泳缓冲液，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。
5 总结
电泳技术是科学界最重要的技术之一，广泛应用于各个领域内，并且琼脂糖凝胶电泳是核酸分析常用的实验技术，琼脂糖电泳技术广泛应用于基础理论研究、农业科学、医学卫生以及工业生产等多种领域中，在分子生物学以及生物化学中具有重要的作用。
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