用血球计数板对酵母菌进行计数

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摘 要：培养液中酵母菌种群数量的动态变化是教材中新加了一个实验。对于这个内容，大多老师不是很熟悉，尤其是新人教版教材中给的这个原理与方法和实际操作有些不同，希望文章对大家有一定的帮助。酵母菌具有生长周期短、增殖速度快的特点，在实验室条件下，用液体培养基培养酵母菌，可以观察酵母菌种群数量随时间变化的情况。对培养液中的酵母菌逐个计数是非常困难的，可以采用抽样检测法进行估算。利用血球计数板在显微镜下直接进行测定，观察在一定的容积中酵母菌的个体数目，然后推算出含菌数。

关键词：血球计数板；计数原理；计算公式

中图分类号：G632 文献标识码：B 文章编号：1002-7661（2013）26-141-02

一、血球计数板的构造

1、血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面，刻有一个方格网。在血球计数板的方格网上刻有9个大方格，只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。

2、计数室刻度有2种：一种是25中格×16小格，而另一种为16中格×25小格（如下图），它们都是由400个小格组成。

计数板每个计数室边长为1mm（即每一个大方格边长为1 mm），则每个计数室面积为1mm2（即每一大方格的面积为1 mm 2）。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1 mm。所以每个计数室的容积为0.1 mm 3 。计数时，如果使用16中格×25小格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100小格）的酵母菌数。如果规格为25中格×16小格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格（即80小方格）的酵母菌数。注意：计数时中格的边界是双线，要以内线为边界。

3、看懂血球计数板上板面数值的含义：

0.1 mm――两嵴的表面比两个平台的表面高，即载玻片与盖玻片之间高度=所加菌液的厚度。

1/400 mm2――每个小格的面积。

XB―K一25中的“25”――计数室有25个中格。

4、每毫升培养液中酵母菌总数=每小格平均菌数×400×l04×菌液稀释的倍数。

16×25的计数板计算公式：细胞数/ml=（100小格内的细胞数100）×400×l04×稀释倍数

25×16的计数板计算公式：细胞数/ml=（80小格内的细胞数80）×400×l04×稀释倍数

二、取样、制片和观察中的几个要求

1、从试管中吸取出培养液进行计数之前，建议将试管轻轻震荡几次。这是为什么？

轻轻震荡几次是为了使试管中酵母菌分布均匀，减少实验误差，使实验更加准确。

2、制片时为什么不直接向计数室滴加酵母液？

因为滴管的1滴体积远大于计数室的0.1 mm3，直接滴加会使盖玻片浮起，所以需要摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少量菌液，从盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入计数室。注意：计数室内不能有气泡，若有气泡则重新制片。

3、发现视野内酵母菌数目太多，挤成一堆，无法进行计数，应进行怎样的处理后，才能进行精确地计数？

用1/10稀释法处理。另取一试管，加入9mL的无菌水；充分振荡培养液后，量取1 mL培养液；加入9mL无菌水的试管中，完全混合后，使其稀释10倍。稀释后，取0.1 mL进行计数。依次进行稀释到每小格3-5个为宜（或所计数的几个中格内的酵母细胞总数小于300个）。

4、对于带芽体的酵母怎样计数？

活酵母有出芽生殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为2个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。

5、对于正好位于中格边框的个体怎样计数？

按左上原则，即对于压在小方格界线上的酵母菌，应只计数相邻两边及其顶角的酵母菌（通常遵循左上原则）。

6、血球计数板如何清洁？

血球计数板使用后，先用自来水浸泡，然后用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晒干或用吹风机吹干或用95%的乙醇或无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察小格内是否残留菌体或其他沉淀物，若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。

三、应用和巩固

例1. 利用计数板可在显微镜下对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由25×16=400个小室组成，容纳液体的总体积为0.1 mm3 。现将l mL酵母菌样品加9 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液。

现观察到图中所示a、b、c、d、e 5个中格80个小室内共有酵母菌440个，则上述1 mL酵母菌样品中约有菌体 个。为获得较为准确的数值，减少误差，你认为可采取的做法是 。

【解析】因为平均每个小格的菌体数=440/80=5.5（个），体积是0.1 mm 3/400，所以，酵母细胞个数/mL=每小格平均菌数×400×l0 4×稀释倍数=5.5×4×106×10=2.2×108 。可采用重复取样求平均值的方法获得较为准确的数值，减少误差。

【答案】 2.2×108 对样品重复计数2-3次，求平均值

例2. 为探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化，甲、乙两小组同学完成了有关实验，定期采用在显微镜下观察并用血球计数器计数。血球计数器是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，它的形状如图A所示，它的规格有两种，一种叫汤麦式（25×16型），另一种叫希利格式（16×25型）如图B所示。