高效液相色谱法测定不同来源罗布麻叶中槲皮素和山柰素的含量

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摘要：目的 采用高效液相色谱法测定罗布麻叶中槲皮素和山柰素含量。方法 采用SUPELCO色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50），检测波长360 nm，柱温30 ℃。结果 槲皮素、山柰素的进样量分别在0.101 4～0.709 8 ?g（r=0.999 6）、0.021 6～0.216 08 ?g（r=0.999 9）线性关系良好。平均回收率分别为98.40%、98.34%，RSD分别为0.98%、0.97%（n=5）。结论 本方法操作简便，结果可靠、准确，能有效地评价罗布麻叶的质量。

关键词：罗布麻叶；槲皮素；山柰素；高效液相色谱法

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0051-03

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.的干燥叶，夏季采收，有平肝安神、清热利水的功效，用于治疗高血压、神经衰弱等症[1]。据文献报道，罗布麻叶含黄酮苷及其他成分，黄酮类是其主要有效成分，有槲皮苷、异槲皮苷、金丝

桃苷、绿原酸等[5]。本试验针对所收集到的不同来源的罗布麻叶进行研究，采用正交试验水解提取-高效液相色谱法测定罗布麻叶中槲皮素、山柰素的含量。

1 仪器与试药

HP1100高效液相色谱仪。甲醇为甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。槲皮素（批号10081-9905，供含量测定用）、山柰素（批号086-200002，供含量测定用），均购自中国药品生物制品检定所。13批不同来源的罗布麻药材，经北京市药品检验所中药室鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18柱SUPELCO（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；流速：0.8 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于5 000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的槲皮素、山柰素对照品适量，分别加80%甲醇，制成每1 mL中含槲皮素30 ?g、山柰素4 ?g的溶液即得。

2.3 供试品制备

2.3.1 正交试验考察水解条件 样品在水解过程中采用正交试验法优选最佳水解条件时发现，影响水解的主要因素为盐酸浓度、水浴温度、水解时间，故确定了由上述3种因素组成、每个因素3个水平的正交表L9（34）进行试验，以槲皮素、山柰素为定量指标，因素水平安排见表1。提取方法及试验条件均同“2.3.2”项方法，结果见表2、表3。

据表2 R值所示，因子A对结果影响较大，最优试验条件可选择为：A1B2C2，即36%盐酸1 mL，90 ℃水浴水解60 min。

据表3 R值所示，因子A对结果影响较大，最优试验条件可选择为：A1B2C1，即36%盐酸1 mL，90 ℃水浴水解30 min。

槲皮素的最佳水解条件与山柰素的最佳水解条件略有差异，采用比对试验，选择最佳水解条件，结果见表4。A1B2C2优于A1B2C1，即最佳水解条件为36%盐酸1 mL，90 ℃水浴水解60 min。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，加入36%盐酸1 mL，置90 ℃水浴中加热回流60 min，取出，立即冷却，移置25 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取槲皮素对照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL置10 mL量瓶中，山柰素对照品溶液0.5、0.75、1、2、3、4、5 mL置25 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀。在上述条件下分析，以对照品进样量（?g）为横座标，峰面积为纵座标，绘制标准曲线。槲皮素回归方程Y=7.405×103X-1.142 9，r=0.999 6山柰素回归方程Y=7.569×103X-16.233 96，r=0.999 9。结果表明，槲皮素0.101 4～0.709 8 ?g范围内线性关系良好，山柰素在0.021 6～0.216 08 ?g范围内线性关系良好。

2.5 稳定性试验

在室温下，将一供试品溶液分别于配制后0、2、4、8、12、24 h，进行测定，结果槲皮素RSD=0.80%，山柰素RSD=0.16%。

2.6 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，重复进样5次，求得槲皮素

RSD=0.14%，山柰素RSD=0.23%。

2.7 重复性试验

取同一样品5份，分别处理测定5次，求得槲皮素RSD=1.21%，山柰素RSD=1.88%。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品，分别精密加入一定量的槲皮素、山柰素对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备，进样10 ?L，计算回收率，结果槲皮素平均回收率为98.40%，RSD=0.98%，山柰素平均回收率为98.34%，RSD=0.97%。结果见表5、表6。

2.9 样品测定结果

取13批不同来源的罗布麻药材，照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，测定，结果见表7。色谱图见图1。

3 讨论

罗布麻叶含有大量的黄酮类成分，本研究采用正交试验，优选了最佳水解时间，测定了罗布麻叶中总槲皮素和总山柰素的含量，可以很好地控制药材的质量。本方法被收载于2005年版《中华人民共和国药典》（一部），用于控制罗布麻叶的药材质量，在实施过程中对药材质量起到了很好的控制作用。本研究通过对不同来源的罗布麻叶中槲皮素和山柰素含量的测定，发现不同来源的罗布麻中槲皮素和总山柰素含量差异较大，使用中应考察质量优劣。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：196-197.

[2] 黄湘兰，曾凡.罗布麻叶化学成分测定[J].时珍国医国药，1998，9（6）：539.

[3] 李冰，胡得福，蒋慧，等.罗布麻叶片中罗布麻叶与野的薄层色谱鉴别[J].中国药事，2003，17（2）：122.

[4] 张云峰，魏东，郭祀，等.大花罗布麻的化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2006，18（6）：954-957.

[5] 李丽红，原忠.罗布麻叶黄酮类成分的研究[J].中国中药杂志，2006， 31（16）：1337-1340.

（收稿日期：2012-02-23，编辑：华强）