葛根素注射液对K562/Adr细胞化疗药物敏感性及机理研究

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摘要：目的：通过观察葛根素注射液协同化疗药物对k562/adr白血病耐药细胞的抑制作用，探讨葛根素增加白血病耐药细胞对化疗药物的敏感性及作用机理。方法：选K562/Adr耐药细胞株作为靶细胞，采用MTF法观察不同浓度的葛根素注射液对K562/Adr耐药细胞增殖的影响，及细胞对化疗药物的敏感性。RT－PCR的方法检测葛根素对耐药相关基因(MDR1/P－gp、MRP)表达的影响。结果：MTT法结果显示低到中等浓度的葛根素(25－100μg/mL)对H562/Adr耐药株的生长与对照组相比无显著差异(P＞0.05)，但当葛根素浓度提高至250μg/mL以上时，对细胞则出现增殖抑制作用，且随浓度增加抑制作用增强。用不同浓度的葛根素和化疗药物(Adr 1μg/mL)合用时结果显示，低浓度(25－50μg/mL)的实验组与对照组无显著差异(P＞0.05)；随着葛根素浓度增加(100-500μg/mL)，Adr对细胞的抑制作用明显，即K562/Adr对Adr的敏感性与葛根素呈剂量依赖美系。K562/Adr细胞经葛根素(100μg/mL)处理1周后，MDR1基因表达受到抑制，是未经处理细胞的2.5倍，MRP基因表达在处理前后无明显变化；当处理1个月后，细胞中MDR1、MRP两基因表达均明显低于未经处理过的细胞，分别是未经处理细胞的2.6倍和3.5倍。结论：葛根素注射液在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖，并能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性；其机制可能通过对耐药相关基因(MDR 1、MRP)表达抑制来起作用。

关键词：葛根素注射液；MDR1；MRP；K562/Adr细胞株

中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1926－03

白血病化疗失败和复发的原因之一就是白血病细胞的耐药性。目前发现白血病细胞的多药耐药(MDR)的产生机制是多因素的，且有不同的耐药表型。因此对于MDR产生的机理及如何克服耐药性问题一直是国内外专家的研究热点。葛根素主要从豆科植物野葛的干燥根中提取、分离而得。具有扩张血管、降血脂血压、改善微循环、抗氧化、抗血栓形成，修复内皮细胞损伤及抑制脑细胞凋亡等药理作用。然而对多药耐药方面研究尚少。本文观察了慢性粒细胞白血病急变细胞株的耐药株K562/Adr在葛根素干预前后对化疗药物的敏感性及作用机制，为揭示白血病细胞耐药机制，寻找有效的逆转耐药药物提供实验依据。

1　材　料

1．1　细胞系

K562/Adr(耐药株)由中国医学科学院天津血液病研究所提供。K562/Adr为阿霉素(Adr)长期诱导K562敏感株而建立的耐药细胞株。

1．2　试　剂

阿霉素(Adramyein，Adr)为意大利法玛西亚普强公司产品。葛根素注射液购自浙江康恩贝制药股份有限公司，每支5mL(5mL：0.25g)。Tfizol购自lnvitmgen公司。

2　实验方法

2．1　细胞系的培养

耐药株K562/Adr在含2μg/mL阿霉素(Adr)的10％小牛血清RPMI 1640培养液中培养传代，实验前14天K562/Adr在元Adr的1640培养液中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

2．2　MTT法检测细胞增殖和药敏试验

取停药2周后的对数生长期细胞作MTT试验：增殖抑制试验(不同浓度的葛根素对细胞的作用)，每孔 200μL培养体系含10％小牛血清、5×104细胞/mL和不同浓度的葛根素(终浓度分别为：25、50、100、250和500μg/mL)每个浓度作4个平行孔，以不加葛根素的作对照组。化疗药物敏感性试验(葛根素与化疗药物Adr的协同作用)，培养体系含小牛血清、细胞和不同浓度的葛根素均与上述增殖抑制试验相同，Adr浓度为1μg/mL，以不加葛根素与Adr的细胞作对照组，上述两组不同组合的细胞均置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h，在终止培养前4h加MTT(5mg/mL)20μL/孔，离心弃上清，每孔加DMSO 150μL，振荡，使沉淀完全溶解后用酶标仪570nm处测吸光度(A)。

2．3　RT－PCR检测葛根素作用后MDR1 MRP基因的表达

2．3．1　总RNA提取　取停药2周后的对数生长期的K562/Adr细胞，在含10％小牛血清和葛根素(终浓度100μg/mL)培养体系中分别培养1周和1个月后，收集足够的细胞进行总RNA提取，提取方法按照Trizol RNA提取试剂操作稍加改进(用Trizol试剂提取2遍)，所提取的总RNA经紫外分光光度计测定260nm和280nm吸光度(A)值及总RNA浓度，A260/A280在1.80以上者用于RT－PCR。分装－80℃保存，备用。

2．3．2　cDNA合成及PCR扩增cDNA合成：20μL逆转录体系中含有：5×逆转录反应缓冲液(5×Bfr)、dNTP、OligodT、RNasin、M－MLV逆转录酶。RNA(60℃溶解10min)1μL、Oligo dT1μL、DEPC Water10μL混匀置于70℃水浴中10min。再加入5×Bfr 5μL、10mM dNTP 2μL、Rnasin 1μL和M－MLV逆转录酶1μL置于37℃水浴70min。

PCR扩增：25μL PCR扩增体系包括：10×PCR反应缓冲液2.5μL、10mM dNTP 0.5μL、MgC12 1.5μL、MDR1或MRP 5’端口3’端引物分别1μL、B－actin 5’端和3’端引物分别1μL、Taqase 0.25μL、RT产物2.5μL、DEPC水13.75μL。反应在DNA扩增仪(美国PE公司)上进行。在扩增前均94℃变性5min。根据MDR1、MRP和β－actin相应的GeneBmak的登录号NM_000927、L05628和X00351用Premier Primer 5.0软件设计引物序列，Intemet网上进行Blast同源性比较。以β－actin作为内对照。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增条件为94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后用72℃延伸10min。

PCR扩增产物电泳：取扩增产物10μL，在1.0％琼脂糖凝胶(含EB)、1×TAE电泳缓冲液上电泳2h，紫外观察，凝胶图像分析系统分析并拍照保存。

3　统计学处理

数据处理用均数±标准差(x±s)表示，两样本比较采用t检验，以SPSS 10.0 for windows软件包统计分析，以P＜0.05为差异显著的标准。

4　结　果

4．1　液体培养葛根素抑制K562/Adr细胞增殖作用

MTT法检测结果显示，低到中等浓度的葛根素(25－100μg/mL)对K562/Adr耐药株的生长与对照组相比无显著差异(P＞0.05)，但当葛根素浓度提高至250μg/mL以上时，则出现对细胞增殖的抑制作用，且随浓度增加抑制作用增强。

4．2　液体培养葛根素协同化疗药抑制K562/Adr细胞增殖作用

葛根素与化疗药物合用，MTT法分析显示仅加Adr组与对照组之间无显著差异(P＞0.05)，1μg/mL的Adr对K562/Adr细胞基本上无杀伤作用，表明此耐药细胞株对Adr已产生耐药。用不同浓度的葛根素和化疗药物合用时，低浓度(25－50μg/mL)的实验组与对照组无显著差异。随着葛根素浓度不断增加(100-500μg/mL)，1μg/mL Adr对细胞的杀伤作用逐渐增强，表明葛根素增强化疗药物(Adr)对耐药细胞的杀伤作用，与化疗药物的协同性呈剂量依赖关系。

4．3　葛根素作用前后对MDR1 MRP基因的表达影响。

4．3．1　K562/Adr耐药株在含葛根素(100μg/mL)培养体系中培养1周后RT－PCR来分析MDR1 MRP基因的表达

RT－PCR结果显示，在β－actin基因表达一致的前提下，经葛根素处理的K562/Adr细胞中MDR1基因表达明显低于未经处理过的细胞，是未经处理细胞的2.5倍；而MRP基因表达在葛根素处理前后无明显变化。提示葛根索作用细胞1周后，能明显抑制MDR1基因表达，说明在一定程度上提高了K562/Adr对化疗药物的敏感性。

4．3．2　K562/Adr耐药株在合葛根素(100μg/mL)培养体系中培养1个月后RT－PCR来分析MDR1 MRP基因的表达在β－actin基因表达基本不变的前提下，经葛根素处理的K562/Adr细胞中MDR1、MRP两基因表达均明显低于未经处理过的细胞，分别是未经处理细胞的2.6倍和3.5倍。提示葛根素提高K562/Adr对化疗药物敏感性的机制可能在于其能够直接抑制产生耐药的基因表达。

5　讨　论

葛根素注射液是从豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根中提取出来的。其作为心血管药物已广泛用于临床心脑血管疾病的预防和治疗，对冠心病治疗有效血药浓度160－240μg/mL。近年来研究发现葛根素的根具有抗肿瘤作用。1990年焦鹭等报道了葛根有效成分S86019 22μg/mL对HL－60细胞的分化有诱导作用。有研究报道，葛根素可以有效的抑制Caco－2及HT－29两种结肠癌细胞的增生。还有报道其可通过增加Bax，减少C－mye及Bcl－2蛋白表达进而激活caspase－3的活性而实现抗癌作用。

本文观察了葛根素注射液对耐药细胞单独作用，及与化疗药物的协同性，结果显示中低浓度的葛根素(25－100μg/mL)，对耐药细胞的增殖无明显变化，但当浓度升高至250μg/mL以上时，耐药细胞则出现增殖抑制现象。葛根素与化疗药物联合应用时，耐药细胞对Adr(1μg/mL)低剂量的敏感性与葛根素呈剂量依赖关系，即葛根素浓度达到1001μg/mL时，诱导剂量的Adr对细胞的抑制作用明显(P＜0.05)，且随葛根素浓度升高，抑制作用也随之增强。说明葛根素能够提高耐药细胞对化疗药物的敏感性，从而协同化疗药物的抑制作用。本文还利用RT－PCR的方法检测葛根素处理前后，K562/Adr细胞内的MDR1、MRP基因表达，结果显示，葛根素(100μg/mL)作用1周，MDR1基因表达与对照比下降了2.5倍，而MRP表达无明显变化；当葛根素(100μg/mL)处理1个月后，MDR1基因表达与对照比下降了2.6倍，MRP则下降了3.5倍。实验表明葛根素增加K562/Adr对化疗药物的敏感性可能与耐药相关基因的下调密切相关。

MDR1/P－gp与MRP同为ABC转运蛋白，二者介导的耐药机制相仿，在有些组织中存在着共表达现象，但MDR1/P－gp与MRP在耐药谱和药物逆转方面又存在一定的差异。MDR1/P－gp胞膜蛋白泵能直接把胞内有毒的物质排出胞外，减少胞内的细胞毒性，从而对化疗药物产生耐药。MRP与MDR1/P－gp不同，它不能直接转运其介导耐药的未经修饰的药物，而需要谷胱甘肽(GSH)的参与，即细胞内代谢产物和各种外来物质如各种化学药物包括抗肿瘤药物分子首先和GSH结合，在ATP水解提供能量下，由MIqP泵出胞外，减少胞内的毒素，而产生耐药。本文结果显示，葛根素能抑制MDR1和MILD基因表达来增加对化疗药物的敏感性。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是一种普遍现象，尤其白血病细胞容易产生耐药。因此寻找逆转肿瘤细胞MDR的药物的途径是提高化疗效果、延长患者无病生存期的可靠途径。