姜黄素对肺纤维化鼠Bcl-xl表达的影响
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[摘要] 目的探讨姜黄素时博莱霉素诱导肺纤雏化大鼠肺组织Bcl―xl基因表达的影响。方法选取SD大鼠96只。随机分为空白组、模型组、醋酸泼尼松龙组、姜黄素组，每组各24只。各组动物于7、14、28 d随机处死8只，取肺组织采用RT―PCR检测Bcl-xl mRNA的表达和免疫组化法检测蛋白的表达，观察姜黄素对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织Bcl―x1基因表达的影响。结果模型对照组Bcl―x1蛋白与Bcl―xl mRNA表达在第7天开始下降，第14天达最低峰。第28天略有回升，但仍低于空白对照组，姜黄素组bcl-xl mRNA及蛋白表达显著高于模型对照组及空白对照组，均有统计学意义(P0.05)，28d姜黄素组Bcl―xl表达高于泼尼松龙组，有统计学意义(P
[关键词]姜黄素；肺纤维化；细胞凋亡；Bcl-xl
[中图分类号]R563 [文献标识码]A [文章编号]1672-4208(2009)19-0001-03
肺纤维化发病机制复杂，缺乏有效的治疗方法，因此肺纤维化的临床和基础成为研究热点。抗凋亡蛋白Bcl―x1能够保护肺组织免受各种刺激，对肺纤维化有潜在治疗的可能。肺纤维化早期应用姜黄素，可降低血清Ⅲ、Ⅳ胶原、层粘连蛋白及透明质酸含量，从而减轻肺组织纤维化程度，但姜黄素是否通过调节Bcl-xl的表达发挥抗肺纤维化的作用尚未见报道，笔者利用博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型，使用姜黄素对大鼠模型肺纤维化的进展过程进行干预，观察其肺组织Bcl-x基因的表达，探讨姜黄索治疗肺纤维化的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠(二级)96只，雄性，4―6周龄，体重180｀220 g，由南华大学实验动物部提供。
1.2 主要试剂 姜黄素由成都思科华生物技术有限公司提供，博来霉素由日本化药株式会社提供，兔抗鼠Bcl―xl多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司，MMLV第一链CDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒购自上海生物工程技术有限公司。
1.3 动物模型的建立 模型组、泼尼松龙组、姜黄素组，均一次性气管内给予博莱霉素(5 mg／kg)制作肺纤维化动物模型。对照组同样方法一次性气管内注入等体积的生理盐水。自造模后第1天起，姜黄素组每天以100 mg／kg姜黄素羧甲基纤维素钠溶液灌胃，正常对照组和模型组每天以1％羧甲基纤维素钠10 ml／kg灌胃1次，泼尼松龙组以5mg／kg每日灌胃1次。大鼠在造模7、14、28 d后分3次取材，每次各组随机处死8只，取材分别进行HE染色，SABC法进行免疫组化和RT-PCR法检测RNA。
1.4 免疫组化检测肺组织Bcl-xl免疫组化SABC法检测，方法步骤严格按照试剂盒说明书进行(Bcl―x1多克隆抗体用1：150稀释)，对照组设计以PBS代替一抗为阴性对照。阳性结果为细胞浆内有棕黄色颗粒且着色明显高于背景者，免疫组化在400倍视野下，每张玻片随即取10个视野，用PIPS-2020高清晰度彩色病理图文分析系统分别测定阳性颗粒的平均吸光度值(A值)，进行分析处理。
RT―PCR检测：目的基因Bcl―xl上游引物序列：5-GGCATCTTCTCCTYCCAGC-3，下游引物序列：5-CCCAGCCTCCGTFATCC-3，扩增片段为439 bp；内参照B―actin上游引物序列：5-TCATCACTATCGGCAATGAGCG-GT-3，下游引物序列：5-ACTCCTGCTTGC TGATCCA-CATCT-3，扩增片段为345 bp。PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成。提取肺组织总RNA，cDNA的合成严格按照试剂盒说明书进行，PCR扩增的条件与参数：94℃3min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃1 min，共30个循环，循环完毕后72℃延伸10 min。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。确认PER反应产物。紫外灯下观察结果、拍照和Total Lab凝胶成像系统软件进行条带分析，测定电泳条带密度，计算BCL-xlmRNA的相对量(A值)：BCL-xlmRNA相对量=BCL-xl产物电泳条带密度／β―actin产物电泳条带密度x100。
1.5 统计学分析 计量资料数据均用均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析(One―Way ANOAY)，两两比较方差齐者采用SNK―Q法。所有数据用SPSS13.0软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 肺组织病理变化 空白组大鼠肺泡结构正常，模型对照组第7天为明显的急性炎症期，14天肺泡炎较前有所减轻，有胶原沉积及斑片状的纤维化改变，28天肺泡炎较前略有减轻，大量肺泡结构萎陷、破坏，大量胶原沉积在新生的毛细血管周围。姜黄素组及泼尼松龙组肺泡炎、肺纤维化的程度都轻于模型对照组。
2.2 大鼠肺组织Bcl-x1免疫组化及mRNA结果肺组织Bcl―xJ蛋白表达阳性反应主要表达于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞，同时段各组Bcl一2蛋白表达不同，正常肺组织有基础表达，模型对照组表达明显减弱，两个治疗组表达高于模型对照组，高于空白对照组，有统计学意义(P0.05)，在第28天肺纤维化形成期姜黄素组和泼尼松龙组比较有统计学意义(P
3 讨论
目前对肺纤维化发病机制的主要研究方向：一是细胞因子网络，二是细胞凋亡。调控细胞凋亡的相关基因包括促凋亡基因和抑制凋亡基因。Bcl―xl为重要的抗凋亡基因之一，其分布在线粒体外膜的浆膜面、核膜和内质网表面，对于稳定线粒体膜有着重要的作用，同时有阻止线粒体释放caspases、凋亡诱导因子和细胞色素c等作用；有研究通过逆转录病毒转染编码超表达Bcl―xl的细胞进行稳定的克隆，对照组选择正常表达Bcl―xl的细胞。正常组与超表达组对比显示较低水平的Bcl―xl含量，两组都放人0、10、100 mU／mJ的博来霉素中观察24、48 h，正常组在48 h观察显示肺炎性改变明显上升并且呈浓度依赖性。与此相反，转染组明显的抵抗了博来霉素诱导的肺炎性改变。Bcl-xl能够抵抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化。Bcl-xl是通过抑制线粒体的通透性转变孔的开放，从而抑制Cyt c的释放而发挥的抗凋亡。而且Bcl―x1还通过维持细胞外基质的完整、调节端粒酶的活性来减少细胞凋亡。Bcl―xl与Bax、钙调蛋白磷酸酶、p53结合蛋白等结合，可阻止p53介导的细胞凋亡以及调节casPase一3途径，发挥其抗纤维化的作用。目前对肺纤维化的治疗仅限于非特异性抗感染。人们正热衷于寻找新的抗纤维化药物在肺纤维化早期进行干预。在以往研究中姜黄素有对多种器官的抗纤维化的作用。在四氯化碳诱导的肝损害大鼠中，姜黄索可减少肝脏胶原沉积、平滑肌肌动蛋白阳性染色面积以及I型胶原mRNA的表达，在体外，姜黄素可减少星形细胞的合成，下调I型胶原mRNA的表达。
另外在肺纤维化中肺纤维化早期应用姜黄素，可降低博来霉素血清Ⅲ、Ⅳ胶原，层粘连蛋白及透明质酸含量，调节肺纤维化大鼠体内自由基水平，从而减轻肺组织纤维化程度。研究发现，姜黄素干预能有效减轻肺纤维化程度，可能机制为姜黄素抑制了TGF―β1/蛋白在肺组织的表达。姜黄素是否通过调节Bcl―xl的表达而抗纤维化的未有报道。本试验研究结果显示，Bcl-xl mRNA及Bcl―xl蛋白表达，姜黄索组高于模型对照组、空白对照组及激素组。姜黄素可能通过上调Bcl―x1基因的表达，发挥抗纤维化的作用，为肺纤维化的治疗提供新的途径和方法。