G蛋白偶联受体56参与轴突发育和髓鞘化

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.06.011

基金项目：国家自然科学基金（81271329）

作者单位：510080 广州，广东省人民医院（广东省医学科学院）急危重症医学部

通信作者：方明，Email：

【摘要】目的 探讨G蛋白偶联受体56（G-protein coupled receptor 56， GPR56）对小鼠脑胼胝体白质内轴突发育和髓鞘化的影响。方法 筛选出Gpr56基因杂合型（Gpr56+/-）和敲除型（Gpr56-/-）小鼠64只，随机数字法分为2组：Gpr56+/-和Gpr56-/-组，每组32只。每组根据小鼠出生后时间分为出生后7 d、14 d、21 d、28 d（P7 d、P14 d、P21 d、P28 d）四个亚组。应用免疫组化染色和Western Blot方法监测神经纤维丝蛋白（NF-200）、髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）在出生后P7 d、P14 d、P21 d、P28 d的Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠脑胼胝体白质中的表达；用P1d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠皮质做体外神经元培养，观察两组神经元轴突的长短；用电镜观察P28d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体白质内轴突髓鞘化，比较轴突直径的大小。结果 与Gpr56+/-小鼠比较，NF-200 和 PLP蛋白在P14 d、P21 d、P28 d 的Gpr56-/-小鼠脑胼胝体白质中的表达明显下降。Gpr56-/-神经元轴突明显短于Gpr56+/-神经元。电镜见P28d Gpr56-/-小鼠脑胼胝体白质内髓鞘化轴突的数量明显减少，轴突直径明显变小。结论 GPR56蛋白分子可能参与了脑白质轴突轴突发育和髓鞘化。

【关键词】G蛋白偶联受体56；胼胝体；轴突；髓鞘化；神经纤维丝蛋白200；髓鞘蛋白脂质蛋白；脑白质；神经元

Effect of GPR56 on axonal development and myelinationDeng Yiyu， Zhou Gaofeng， Zeng Hongke， Zeng Wenxin， Jiang Wenxin， Fang Ming. Emergency and Critical Care Department， Guangdong General Hospital （Guangdong Academy of Medical Sciences）， Guangzhou 510080， China

Corresponding author： Fang Ming， Email：

【Abstract】Objective To determine the likelihood of G-protein coupled receptor 56（GPR56） induces axonal development and myelination in the corpus callosum of mouse brain.Methods A total of 64 Gpr56+/- and Gpr56-/-mice were selected and randomly divided into two groups： Gpr56+/- group （n=32） and Gpr56-/-group （n=32）. According to number of days after birth， each group was further divided into 4 subgroups including P7d， P14d， P21d and P28d subgroups. Levels of neurofilament-200 （NF-200） and proteolipid protein （PLP） of myelin basic protein in corpus callosum were measured with immunohistochemistry staining and Western blot in P7d、P14d、P21d、P28d Gpr56+/- and Gpr56-/-mice. Gpr56+/- and Gpr56-/-neurons were cultured using P1d Gpr56+/- and Gpr56-/-mouse brain. The lengths of Gpr56+/- and Gpr56-/-neuronal axon were measured and compared with Image J software. Axonal myelination in the corpus callosum of mouse brain in each group was observed under electronic microscopy and the axonal diameters between subgroups were compared. Results The levels of NF-200 and PLP in the corpus callosum in P7d、P14d、P21d、P28d Gpr56-/-mice decreased significantly compared with Gpr56+/- mice. The length of Gpr56-/-neuronal axon was shortened compared with Gpr56+/- neuronal axon. The number of myelinated axons was obviously reduced in the corpus callosum in P28d Gpr56-/-mice. The diameter of axon in the corpus callosum of P28d Gpr56+/- mouse is longer than that of P28d Gpr56-/-mouse. Conclusions GPR56 may be involved in axonal development and myelination in the corpus callosum of mouse brain.

【Key words】G-protein coupled receptor 56； Corpus callosum； Axon； Myelination； Neurofilament-200； Proteolipid protein； Cerebral white matter； neuron

轴突的髓鞘是成熟少突胶质细胞突起缠绕轴突形成的多层脂质结构，是神经元轴突与少突胶质细胞突起相互作用的结果[1-2]。大量的信号分子参与了这一复杂的相互作用。此过程包括3个方面：OLs增殖分化成熟；神经元轴突发育；成熟OLs向目标轴突的迁移、OLs突起黏附到神经元轴突上和OLs突起缠绕轴突形成髓鞘[3-4]。其中神经元轴突的正常发育在完成轴突髓鞘化起着关键的作用。有研究表明神经元轴突的电信号可以诱导少突胶质前体细胞的生存和增殖，可以增加少突胶质细胞内髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein， MBP）基因的表达[5]。因此神经元轴突的正常发育是完成轴突髓鞘化的必要条件。

大量分子会影响神经元轴突的发育。GPR56属于黏附性G蛋白偶联受体家族。既往报道表明：人GPR56基因发生R38Q、R38W、Y88C、C91S、C346S、W349S、R565W、L640R突变会导致双侧大脑皮层多小脑沟回畸形和白质发育缺陷[6-8]。GPR56基因突变所致白质的萎缩、局灶MRI-T2强信号类似于多发性硬化的病理改变[9]，提示GPR56分子可能参与了脑白质的发育和轴突髓鞘化。为了证实GPR56蛋白分子是否参与神经元轴突的发育和髓鞘化，本研究利用Gpr56基因敲除（Gpr56-/-）的小鼠，用免疫组化和Western blot观察髓鞘蛋白脂质蛋白（proteolipid protein， PLP）、轴突发育相关神经纤维丝蛋白（Neurofilament-200， NF-200）在成年Gpr56-/-小鼠胼胝体中表达。通过体外神经元培养观察Gpr56+/-和Gpr56-/-神经元轴突生长情况，比较两种神经元轴突的长度。用电镜观察成年Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体内轴突直径的大小和髓鞘化情况。通过上述系列实验研究证实GPR56分子是否参与了神经元轴突发育和髓鞘化。

1 材料与方法

1.1 材料

Gpr56基因敲除小鼠从美国哈弗大学医学院附属波士顿儿童医院Piao xianhua博士实验室赠获。Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠在暨南大学医学院实验动物中心饲养，实验条件下自然饮食。购买商业化抗体：鼠抗NF-200（Sigma-Aldrich， Saint Louis， MO， USA， Cat.No.N0142）、羊抗PLP （Santa Cruz，Santacruz， CA， USA， Cat.No.sc-23570）、鼠抗Tuj1（Santa Cruz，Santacruz， CA， USA， Cat.No.sc-58888）、鼠抗β-actin （Sigma-Aldrich， Saint Louis， MO， USA， Cat.No.A1978）。

1.2 方法

1.2.1 实验设计方法 将出生后小鼠进行基因分型，分为Gpr56+/-组和Gpr56-/-组。每组32只。每组根据小鼠出生后时间分为出生后7 d、14 d、21 d、28 d（P7 d、P14 d、P21 d、P28 d） 4个亚组。每组在出生后P14 d、P21 d和P28 d各取3只小鼠进行灌流固定后行免疫荧光组织化学染色；取5只小鼠取新鲜的胼胝体进行Western免疫印迹实验；在出生后P28 d各取3只小鼠进行电镜检测。

1.2.2 神经元培养及神经元轴突生长观察、长度测量 将新生1 d小鼠进行genotyping后分为Gpr56+/-和Gpr56-/-组，分别进行神经元培养。将小鼠断头，分离鼠脑，置于PBS中，剥去血管脑膜，分离皮质，剪碎。胰酶消化15 min后吹散，筛网过滤。800 r/min离心2 min后弃上清，细胞沉淀用DMEM培养基悬浮，计数细胞密度。以0.75×105个/孔的密度接种在用多聚赖氨酸包被好的24孔板中。培养至24 h后用PBS快速洗3次，随后向24孔板中加入4%多聚甲醛室温下固定1 h。再用PBS洗3次，10 min/次，用Tuj1抗体4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，每次10 min，滴加带绿色荧光的二抗工作液（goat anti-mouse IgG-FITC， Santa Cruz，Santacruz， CA， USA， Cat.No.sc-2010）室温下孵育1 h。PBS清洗三遍，用DAPI染核，再用mounting medium封片。在40倍物镜荧光显微镜下随机挑选30个视野进行拍照，每个视野至少有5个神经元。应用Image J software （SummaSketch Ⅲ Summagraphics， Seattle， WA）测量每个神经元轴突的长度。

1.2.3 免疫组织化学染色 每组动物灌流、固定后移入30%蔗糖溶液过夜。冰冻切片机-20 ℃低温取视交叉水平冠状切片，片厚20 μm。正常工作血清封闭。与Western免疫印迹中同一来源的PLP（1∶200）、NF-200（1∶200）一抗4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，每次10 min，滴加带红色荧光或带绿色荧光的二抗工作液室温下孵育1 h。PBS清洗三遍后用mounting medium封片。在荧光显微镜（Olympus System Microscope Model BX53）下观察实验结果。

1.2.4 Western blot印迹 新鲜脑组织胼胝体提取等量的蛋白（100 μg）进行DSD-PAGE（12%T，5%C）分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温用5%牛奶封闭30 min，NF-200（1∶200）、PLP（1∶500）一抗4 ℃孵育过夜后，漂洗3次，每次10 min。用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶500）稀释液室温孵育1 h后，用化学荧光检测系统染色洗片。采用FluorChem 8900，version 4.0.1（Aipha Innotech Corporation，USA）软件测量免疫条带的光密度。

1.2.5 电镜 出生后28 dGpr56+/-和Gpr56-/-小鼠各3只用2%福尔马林+3%戊二醛溶液灌流固定后，取大脑胼胝体制成1 mm3组织块。用震荡切片机将组织块切成80～100 μm的切片。0.1M磷酸盐缓冲液漂洗后，用1%四氧化锇后固定2 h，脱水、树脂包埋。切超薄切片，在Philips CM 120电镜（FEI Company， Hillsboro， Oregon， USA）下观察。从每只动物胼胝体近中侧取四个非重叠视野，拍不同倍数的照片。用Image J software （SummaSketch Ⅲ Summagraphics， Seattle， WA）测量每个神经纤维轴突和总神经纤维（轴突+髓鞘）的直径。用公式g-ratio=神经纤维轴突直径/总神经纤维（轴突+髓鞘）的直径计算g-ratio值。这个公式等同于神经纤维轴突横截面积除以总神经纤维的横截面积。比较Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠神经纤维直径的大小。研究者采取盲法测量Gpr56+/-和Gpr56-/-组g-ratio值，两组之间的比较采取成组t检验。

1.2.6 统计学方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组之间比较用成组t检验，以P

2 结果

2.1 NF-200、PLP在Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中的表达

用免疫组织化学染色和Western blot免疫印迹方法检测与轴突髓鞘化相关的蛋白PLP和神经元轴突相关蛋白NF-200在Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中的表达。免疫组织化学染色结果显示与同时间点Gpr56+/-小鼠相比较PLP和NF-200在P14 d、P21 d、P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体中表达明显降低（分别见图1 A-F， 图2 A-F）。用FluorChem 8900，version 4.0.1（Aipha Innotech Corporation，USA）图像分析软件分析Western免疫印迹蛋白条带光密度值并做统计学分析。结果显示与同时间点Gpr56+/-小鼠相比较PLP在P7 d、P14 d、P21 d、P28d Gpr56-/-小鼠胼胝体中表达明显降低（见图1 G-F）（P

2.2 体外神经元培养Tuj1荧光染色观察神经元轴突长度

将来自Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠大脑皮质神经元培养24 h后，进行Tuj1染色。Tuj1是神经元的标志物，该染色可以清晰观察神经元的形态。可以清楚看到大部分Gpr56+/-神经元轴突长于Gpr56-/-神经元（图3A-F）。采用Image J software （SummaSketch Ⅲ Summagraphics， Seattle， WA）测量每个神经元轴突的长度进行统计学分析，Gpr56+/-神经元轴突长度在40～60 μm和大于60 μm范围内百分比明显多余Gpr56-/-神经元（图3G）。大部分Gpr56-/-神经元轴突长度集中在20～40 μm范围之内（图3G）。这些结果表明：Gpr56基因敲除会导致神经元轴突生长障碍。

2.3 电镜观察Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中轴突大小和髓鞘化

在低倍镜下可以观察到P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体中发生髓鞘化的轴突数目明显减少，而在P28 d Gpr56+/-小鼠胼胝体中发生髓鞘化的轴突数目明显增多（见图4A，B）。在P28 d Gpr56+/-小鼠胼胝体中轴突髓鞘高倍电镜下为明暗相间的同心圆板层排列，结构完整，板层致密，边缘光滑（见图4 C）。在P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体中轴突髓鞘在高倍电镜下可见髓鞘板层紊乱，髓鞘与轴索间隙增大，外形不规则，有空泡出现（见图4D）。高倍镜下显示P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体中轴突髓鞘厚度明显变薄（见图4D）。与P28 d Gpr56+/-小鼠轴突髓鞘相比，P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体中轴突髓鞘的g-ratio值明显变大（见图4E）（P

免疫荧光组织化学染色显示PLP在出后14 d、21 d和28 d Gpr56+/-（图1 A， B， C）（x200）和Gpr56-/-（图1 D， E， F）（×200）小鼠胼胝体中表达。Western免疫印迹显示PLP在出生后7 d、14 d、21 d和28 d Gpr56+/-和Gpr56-/-（图1 G）小鼠胼胝体中表达。Western免疫印迹条带光密度测定后统计学分析结果见图1 H（aP

图1 PLP在Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中表达

Fig 1 PLP protein expression in the PWM of Gpr56-/- and Gpr56+/- mice

3 讨论

本研究结果显示，在出生后P14 d、P21 d和P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内PLP表达量明显降低。髓鞘主要由脂和蛋白质组成，其中脂占70%以上。蛋白质主要由MBP和PLP组成，其中MBP占髓鞘蛋白的30%，PLP占髓鞘蛋白的50%[10]。MBP和PLP是成熟髓鞘的标志性蛋白[10]。髓鞘的形成障碍会导致MBP和PLP的合成减少，因此可以表明Gpr56基因敲除可导致轴突低髓鞘化。电镜结果发现，在P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内髓鞘化

免疫荧光组织化学染色显示NF-200在出生后14 d、21 d和28 d Gpr56+/-（图2A， B， C）（x200）和Gpr56-/-（图2D，E，F）（×200）小鼠胼胝体中表达。Western免疫印迹显示NF-200在出生后7 d、14 d、21 d 和28 dGpr56+/-和Gpr56-/-（图2G）小鼠胼胝体中表达。Western免疫印迹条带光密度测定后统计学分析结果见图2F（aP

图2 NF-200在Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中表达

Fig 2 NF-200 protein expression in the PWM of Gpr56-/- and Gpr56+/- mice

Gpr56+/-神经元轴突（A-C）（×400）明显长于Gpr56-/-神经元轴突（D-F）（×400）。统计学分析显示Gpr56+/-和Gpr56-/-神经元轴突长度在20～40 μm、40～60 μm、>60 μm范围内的百分比见图3G（aP

图3 Gpr56+/-和Gpr56-/-神经元轴突生长

Fig 3 Tuj1 immunostaining showed outgrowth of Gpr56+/- and Gpr56-/- neuronal axons

低倍镜示与P28 dGpr56+/-小鼠（图4 A）（×5000）相比较，在P28 dGpr56-/-小鼠（图4 B）（×5000）胼胝体中髓鞘化的轴突数目明显减少。高倍镜示与P28 dGpr56+/-小鼠（图4 C）（×11000）相比较，P28 dGpr56-/-小鼠（图4 D）（×11000）轴突直径变细，髓鞘的厚度变薄。图4 E示P28 d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中轴突髓鞘g-ratio值比较（aP

图4 电镜示P28 d Gpr56+/-和Gpr56-/-小鼠胼胝体中轴突髓鞘化

Fig 4 EM showing axonal myelin sheath in the corpus callosum cross-sections collected from P28 Gpr56-/- （B， D） and littermate control Gpr56+/- （A， C） mice

轴突的数目明显减少，髓鞘的厚度变薄。电镜发现与免疫组化、Western blot结果一致，进一步证实了Gpr56基因参与了轴突的髓鞘化过程。

Gpr56基因敲除后导致小鼠脑白质轴突低髓鞘化，这可能与Gpr56基因敲除后影响轴突的发育有关。为了证实这一点，笔者采用轴突标志性蛋白NF-200抗体染色观察Gpr56-/-小鼠胼胝体内轴突生长情况[11]。神经微丝蛋白（neurofilament protein，NF）是构成神经元胞体和轴突细胞骨架的主要成分，对维持细胞的正常形态，参与细胞的物质转运和细胞运动，参与神经元信息的传递和DNA的复制、转录等方面起着重要作用[12-13]。NF按相对分子质量可分为NF-68、NF-150和NF-200[14-15]。NF-68组成神经丝的核心，NF-150和NF-200为“交联”蛋白，组成神经丝的侧臂[16-17]。NF-200仅存在于轴突中，因此NF-200可以反映轴突的生长情况[16-17]。当神经元轴突生长发生障碍时NF-200表达就会降低[16-17]。免疫荧光染色和Western blot发现：与对应的Gpr56+/-小鼠比较，P14 d、P21 d、P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内NF-200表达明显降低且NF-200阳性轴突变短排列紊乱。电镜结果也发现P28 d Gpr56-/-小鼠胼胝体内神经元轴突的直径明显变小。在体外进行Gpr56+/-和Gpr56-/-神经元培养24 h后，用神经元特异性标志蛋白Tuj1染色发现：Gpr56-/-神经元轴突长度明显短于Gpr56+/-神经元轴突。因此，体外细胞培养实验结果与动物实验结果一致。建立在这些实验基础之上，可以推测Gpr56蛋白分子是神经元轴突正常发育所必需，缺乏它会导致轴突发育障碍，从而也会导致脑白质轴突低髓鞘化。这一发现对于理解和治疗轴突损伤相关性疾病有极其重要的意义。

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（收稿日期：2014-03-11）

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