枯草芽孢杆菌KJ发酵豆粕制备新型蛋白肽饲料的研究

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摘要: 以脱脂豆粕粉为原料，具有分泌丰富酶系能力的菌株枯草芽孢杆菌kj为发酵菌株,通过单因素试验，确定最优发酵降解条件.得出最佳发酵工艺：豆粕粉6%，葡萄糖2%，接种量9%，菌龄12h，经发酵48h后，豆粕粉蛋白中小分子肽含量达58.86%，比发酵前提高了37.99%.

关键词: 枯草芽孢杆菌KJ；豆粕粉；小分子肽

中图分类号:S 816.42

文献标志码:A文章编号:1672-8513(2011)06-0462-04

Study on the Production of New Protein Feeds by Fermentation of Soybean Meal Power of Bacillus subtilis KJ

HE Yongjin1，WU Meiqiong1，CAI Congyu1，XIE Bifeng2

(1. Minnan Science and Technology Institute, Fujian Normal University, Nanan 362332, China; 2. College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China)

Abstract: Defatted soybean meal powder was used as substrate and fermented by the stain Bacillus subtilis KJ which could secret proteinase. The optimum conditions of microorganisms for the degraded soybean meal power was defined by the single-factor test. The results showed that the optimum conditions were as follows: the soybean meal content was 6%, the inocluation amount was 9%, the liquid seed with the cell age of 12h, the fermentation time was 48h, the small peptides content of soybean meal protein could reach 58.86 %, which was 37.99% more than the small peptides content under the conditions before fermented.

Key words: Bacillus subtilis KJ; defatted soybean meal power; small peptides

随着畜牧业的发展，饲料的需求量越来越大.而饲料生产量，尤其是蛋白饲料的不足已经成为全球性问题[1].面对饲料资源严重匮乏的形势，迫切需要开发新型绿色的蛋白饲料资源.在蛋白饲料开发利用中，用生物技术特别是微生物发酵手段来生产蛋白饲料越来越受到人们的重视.饲用活性肽饲料作为一种新型绿色蛋白饲料或添加剂，具有促进动物生长[2]、增强机体免疫力[3]、促进微量元素吸收[4]和肠道黏膜结构及功能发育[5]等多种生物学功能.采用微生物发酵处理豆粕粉，是指利用优良的微生物生长时分泌丰富的酶系降解豆粕粉中蛋白质，使其转化成具有生物活性的小肽蛋白.该方法可以有效地克服其他制备方法的不足，如酶解法制备的小肽带有苦味[6]，物理化学处理法[7]导致蛋白质变性等.本研究利用实验室分离筛选适宜发酵豆粕的菌株，对其液体发酵工艺条件进行优化，旨在为饲用小肽的发酵工艺扩大化做准备.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌KJ，由本实验室分离、筛选并保存.

1.1.2 培养基

斜面培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基.

种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基.

发酵出发培养基：豆粕粉10%，NaCl 0.5%，一定量水，自然pH, 121℃灭菌20min.

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养和最适合的生长条件

1) 种子的制备：按1管菌/10mL无菌水的比例制成一定浓度菌悬液，吸取1mL于75mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，37℃、220r/min振荡培养48h.

2) 菌种的最适合的生长条件：枯草芽孢杆菌KJ接于种子培养基培养，以OD600和活菌数为综合指标，初步探讨装液量、初始pH、温度3个因素对菌种生长的影响.

1.2.2 菌株降解豆粕粉的条件优化

将上述最适合生长的条件下，得到最佳的微生物发酵菌剂，以小肽含量为指标，探讨发酵出发培养基的组成、不同NaCl浓度、碳源种类、碳源浓度、接种量、菌龄以及发酵时间对发酵性能的影响.通过对各因素的优化达到最佳的降解条件.

1.2.3 粗蛋白含量的测定

采用微量凯氏定氮法测定得样品的总氮量.粗蛋白质含量(%)=6.25×总氮量(%).

1.2.4 小分子肽含量的测定――双缩脲法

1） 标准曲线绘制：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA），配制成10mg/mL的标准蛋白溶液.取12支试管分2组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1mL，然后加入4mL双缩脲试剂,充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30min，于540nm处进行比色测定.用未加蛋白质溶液的第1支试管作为空白对照液.取2组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线.

2）液体发酵液的处理：取液体发酵液20mL，4℃，离心10min（4000r/min），取上清液5mL，加入等量的75%(pH=80)的乙醇沉淀2h，再离心5min（1000r/min），取上清液一定量进行双缩脲法测定[8].

1.2.5 发酵蛋白肽的分析(SDS-PAGE电泳)

1) 凝胶制备：凝胶板由含5%丙烯酰胺的浓缩胶和含15%丙烯酰胺分离胶.

2) 加样：吸取处理好的样品20μL与等量的2倍溴酚蓝上样液，混匀后，吸取16μL置于凹槽中.

3) 电泳：开始时电流为10mA左右，待样品进入分离胶后，改为20~30mA，当染料前沿距胶框底1.5cm时，停止电泳.

4） 染色与脱色:用1%考马斯亮蓝染色，染色1h左右，再用乙醇-冰醋酸脱色液脱色，将凝胶板放在扫描仪进行扫描.

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌KJ的最适生长条件

为了得到茁壮的微生物菌剂，初步研究生长曲线、装液量、初始pH、温度对枯草芽孢杆菌KJ的生长条件的影响.

2.1.1 枯草芽孢杆菌KJ在种子培养基上的生长曲线

枯草芽孢杆菌KJ在种子培养基上生长，2~8h为枯草芽孢杆菌KJ的对数期，培养8h为稳定期（8~20h），培养到22h进入衰退期.

2.1.2 装液量对枯草芽孢杆菌KJ生长的影响

由图2可以看出，当装液量为100mL时，培养液的OD600值和活菌数均达到最高点，即OD600为2.357，菌数达6.7×108 mL-1.这可能因为在不同装液量下，发酵液与空气的接触面积不同，造成摇瓶发酵系统的供氧能力的影响.

2.1.3 初始pH对枯草芽孢杆菌KJ生长的影响

由图3可知，初始pH对枯草芽孢杆菌KJ的生长呈现出先上升再下降的趋势.pH在7.0~8.0范围内，其OD600值相对比较稳定，菌数能达到6.4×108 mL-1以上.培养液初始pH偏高或偏低对其生长都有一定的抑制作用.

2.1.4 温度对枯草芽孢杆菌KJ生长的影响

温度是限制枯草芽孢杆菌KJ生长的一个关键因子，在一定的温度范围（33~37℃）内枯草芽孢杆菌KJ的生长速率随温度升高而加快，同时活菌数也随温度升高而增大，但过高的温度会抑制枯草芽孢杆菌KJ的生长.由此可知，枯草芽孢杆菌KJ最适温度为37℃.

通过以上3个因素的初步研究，获得枯草芽孢杆菌KJ最佳生长条件：装液量为100mL，初始pH为7.0~8.0，温度为37℃.

2.2 枯草芽孢杆菌KJ液体发酵条件

豆粕粉出发培养基经过灭菌后，其pH为5.5处于弱酸性，对微生物的最适生长产生较大影响.因此，将灭菌前的培养基用碱微调pH至7.0~8.0范围内.

2.2.1 不同豆粕粉质量分数对发酵性能的影响

微生物接于不同豆粕粉浓度培养基中，培养发酵48h，结果见图4.以接种前后培养液中小肽含量的差值为指标来衡量发酵性能.由图4得出：当豆粕粉质量分数为6%时，枯草芽孢杆菌KJ的降解能力最强.培养基中豆粕粉含量高低影响了发酵液的性质，导致微生物降解蛋白质的能力降低.经单因素方差分析，豆粕粉质量分数对降解性能的影响非常显著（P＜0.01）.

2.2.2 不同渗透压对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响

研究不同渗透压对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响.结果得到：不同的NaCl浓度对发酵性能的影响不明显.这说明豆粕粉可能本身含有适量的盐类物质，可以维持枯草芽孢杆菌KJ正常生长所需的渗透压.通过单因素方差分析，不同渗透压对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能无显著影响（P＞0.05）.

2.2.3 不同碳源对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响

研究原料中添加2%麸皮、葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糖蜜对发酵性能的影响，结果见图5.从图5可知，以2%葡萄糖作为碳源，微生物发酵效果最好，小肽含量达4645%，玉米淀粉次之达422%，麸皮和蔗糖都比较差.经单因素方差分析，不同碳源对微生物发酵性能的影响极显著（P＜0.01）.

2.2.4 碳源质量分数对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响

由图6可知，当原料中分别添加2%或3 %的葡萄糖时，枯草芽孢杆菌KJ的降解能力都处于较高水平，发酵液的小肽含量均能达47 %以上.培养基中葡萄糖质量分数高低影响了培养基中的C/N不合理，致使微生物对豆粕粉的利用率降低.通过单因素方差分析，碳源质量分数对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响极显著（P＜001）.本实验考虑发酵成本方面，最终选择2%的葡萄糖作为碳源.

2.2.5 接种量对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响

将不同接种量的液体种子接入到在上面优化的培养基上进行发酵实验，48h后测定发酵液的小肽含量，结果如图7.由图7可知，当接种量为9 %时，枯草芽孢杆菌KJ对豆粕粉中蛋白质的降解能力最理想，接种量为7%次之.经单因素方差分析，接种量对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能有极显著影响（P＜0.01）.

2.2.6 种龄对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响

根据枯草芽孢杆菌KJ的生长曲线，选取种龄的7个时间点落在生长期后期到平稳期前中期，处在这个时间段的种龄有利于发酵过程的稳定性及豆粕粉的利用率.由表1可知：接种菌龄为12h的液体种子时，发酵性能效果最好；菌龄为13h的种子次之.由单因素方差分析，种龄对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响显著（0.01＜P＜0.05）.

2.2.7 发酵时间对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能的影响

在上述优化的基础上，分别于30，36，42，48，54，60，66h时测定小肽含量，结果见表2.由表2可得发酵时间为48h时，菌种的降解能力最强.随着发酵时间的延长，发酵液的小肽含量反而降低，可能是由于微生物进入衰退期和发生自溶现象，从而影响降解效果.通过单因素方差分析，发酵时间对枯草芽孢杆菌KJ发酵性能有极显著影响（P＜0.01）.

2.3 发酵液蛋白电泳图谱

将枯草芽孢杆菌KJ接于优化后的培养基进行发酵，得到发酵液处理后进行SDS-PAGE电泳.结果如图8.由电泳图谱可以看出，经过发酵后，分子质量在（443~664）ku的大分子蛋白质绝大部分被分解，分子质量在443ku以下的蛋白质则被完全降解.

3 结论

利用枯草芽孢杆菌KJ对豆粕粉进行发酵，可以提高产品中活性小肽含量.此外，豆粕通过发酵还能提高适口性、增加有效成分[9-10]等各项指标.本文主要通过研究豆粕粉质量分数、渗透压、碳源种类及浓度、种龄、接种量和发酵时间对枯草芽孢杆菌KJ的生长和发酵性能的影响，得出以下结果：

1) 通过对微生物生长条件研究，确定了发酵菌剂培养的条件：装液量为100mL初始pH为7.0~8.0，温度为37℃.

2) 研究对枯草芽孢杆菌KJ发酵过程的条件控制.得出了最优发酵条件为：豆粕粉6%，葡萄糖2%，接种量9%，菌龄12h，经发酵48h后，发酵液中的小肽含量达58.86%，比优化条件提高了37.99%.

本研究运用枯草芽孢杆菌KJ进行发酵法制备新型的优质绿色蛋白肽饲料产品具有生产成本低、降解能力强的优点，表明微生物发酵法生产饲用活性肽将具有广阔前景.