苦玄参不同提取部位抑制2215细胞分泌HBeAg和HBsAg的实验研究
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[摘要] 目的:观察苦玄参不同提取部位的含药血清对2215细胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用。方法:将含药血清作用于2215细胞,然后用酶联免疫法测定HBsAg和HBeAg的水平。结果:苦玄参各提取部位对HBeAg有明显的抑制作用,但没有明显的量效关系。其中乙醇总提取部位、水提取部位和正丁醇提取部位对HBeAg的抑制效果比乙酸乙酯提取部位好,抑制率最高可达80%以上(P
[关键词] 苦玄参;2215细胞;酶联免疫法;血清药理学
[中图分类号] R329.2+8[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)06(a)-027-03
Experimental study on the inhibitory effect on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cells of different extracts of Picria fel-tarrae Lour
ZENG Jinqiang1*, PAN Xiaojiao2 ,YANG Ke2, WEI Zhiying2, CHEN Chen2
(1.Guangxi Frontier Hospital, Nanning 530022, China; 2.Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530001, China)
[Abstract] Objective: To observe the inhibitory effect on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cells of different extracts in serums of Picria fel-tarrae Lour. Methods: The different extracts in serums of Picria fel-tarrae Lour were used to act on 2215 cells and the enzyme linked immune response was used to investigate the level of HBeAg and HBsAg. Results: All extracts showed the obvious inhibitory activity on HBeAg, but there wasn't any obvious dose-effect relationship. The EtOH, BuOH and H2O extracts showed the better inhibitory activity on HBeAg than the EtOAc extracts did. The best inhibitory rates of them on HBeAg were more than 80% (P
[Key words] Picria fel-tarrae Lour; 2215 cells; Enzyme linked immune response; Seropharmacology
苦玄参为玄参科植物苦玄参(Picria fel-tarrae Lour)的干燥全草,别名苦草、蛇总管。苦玄参味苦、性寒,具有清热解毒、消肿止痛的功能,用于感冒风热、咽喉肿痛、痄腮、胃热腹痛、痢疾、跌打损伤、疖痈、毒蛇咬伤等[1]。苦玄参在广西壮族自治区已得到较好的开发应用,多个以苦玄参为主要成分的中成药已上市销售[2]。目前对苦玄参只有解热和抗菌的药理研究[3-4],尚无其抗乙肝的相关试验研究报道。笔者对苦玄参不同提取部位含药血清的体外抗乙肝作用进行了初步研究,现报道如下:
1 材料与方法
1.1 药材
苦玄参经广西中医学院药用植物教研室韦松基副教授鉴定为玄参科植物苦玄参(Picria fel-tarrae Lour.)的干燥全草。
1.2 动物
昆明种小白鼠,体重22～26 g,雌雄兼用,由广西中医学院实验动物中心提供,合格证号:桂医动字第11004号。
1.3 细胞
HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的2215细胞,购自中国医学科学院中国医药生物技术研究所。
1.4 仪器与试药
仪器:二氧化碳培养箱(美国Forma公司);倒置显微镜(德国Leica公司);酶标仪(奥地利Sunrise公司)。
试药:新生牛血清(NBS,杭州四季青公司,批号:070720);卡那霉素(Sigma分装);二甲基亚砜(DMSO,上海生物工程有限公司,批号:54186);HBsAg、HBeAg检测试剂盒(上海荣盛生物科技有限公司,批号:20070606、20070712)。
1.5 方法
1.5.1 苦玄参不同提取部位的制备取苦玄参95%乙醇提取干浸膏30.1 g(每克干浸膏相当于8.7 g生药),溶于300 ml水中,依次用适量乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别合并各萃取层,减压回收溶剂,备用。另取30.1 g苦玄参干浸膏和上述各提取部位,分别溶于适量水中,最后定容成100 ml,4℃保存备用。
1.5.2 含药血清的制备[5]取小鼠40只,体重22～26 g,雌雄兼用,分为5组:空白血清组(灌胃给予生理盐水),乙醇总提取物血清组,乙酸乙酯提取部位血清组,正丁醇提取部位血清组,水提取部位血清组。含药血清组按每次20 ml/kg(相当于52.4 g生药/kg)剂量灌胃给药,每天给药2次(每天的总给药量约为苦玄参半数致死量的1/2),连续3 d,末次给药后1 h,摘眼球取血,离心分离血清,56℃灭活30 min。用MEM培养液稀释成40%、20%和10%的血清浓度,过滤,4℃保存备用。
1.5.3 细胞培养2215细胞用MEM培养液培养(培养液含10%胎牛血清,0.03%谷氨酰胺,G 418 380 μg/ml,卡那霉素50 U/ml,pH 7.2),用0.25%胰酶消化3～4 min后计数,配制成1×105个/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔100 μl;然后将其置于5%的CO2培养箱中,37℃培养24 h,待细胞长成单层后进行实验。将含各浓度血清的MEM培养液加入96孔板中,每孔100 μl,平行设3孔,使含药血清最终浓度分别为20%、10%和5%。同时设空白血清组、无血清细胞对照组和培养液空白对照组。收集第4天细胞培养上清液,在450 nm波长处用酶标仪测OD值。
1.5.4 抑制率按以下公式计算抑制率,抑制百分率(%)=[(无血清细胞对照组OD值-苦玄参提取物血清组OD值)/(无血清细胞对照组OD值-培养液空白对照组OD值)]×100%。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 14.0软件对实验所得的OD值进行组间t检验,P
2 结果
见表1。
结果表明,苦玄参各提取部位对HBeAg有明显的抑制作用,但没有明显的量效关系。其中乙醇总提取部位、水提取部位和正丁醇提取部位对HBeAg的抑制效果比乙酸乙酯提取部位好,抑制率最高,可达80%以上(P
3 讨论
乙型肝炎病毒(HBV)是引起急、慢性病毒性肝炎的主要病原体之一,故寻找有效的抗HBV药物是当务之急。目前临床已有不少用中药治疗乙型肝炎的观察[6-7],但尚缺乏研究依据,而HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的2215细胞系的建立,为抗HBV药物的筛选提供了有效手段[8]。笔者利用血清药理学方法,研究苦玄参不同提取部位在体外对2215细胞分泌hbeag和hbsag的抑制作用,结果表明,苦玄参不同提取部位含药血清都有较好的体外抗乙肝作用,提示苦玄参不同提取部位可能在体内对乙肝病毒具有抑制作用。至于苦玄参通过何种途径实现其抑制2215细胞分泌HBeAg和HBsAg,还有待于进一步研究;而其具有抑制作用的化学单体有哪些也有待于进一步筛选。
[参考文献]
[1]广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁:广西科技出版社,1992:225.
[2]陈勇.几种含苦玄参的中成药定性定量研究[J].中国现代应用药学,2000,17(2):106.
[3]李萍,周芳,陈勇.苦玄参提取物解热作用的实验研究[J].时珍国医国药,2007,18(11):2638.
[4]黄燕,肖艳芬,甄汉深,等.苦玄参体外抗菌作用的实验研究[J].广西中医药,2008,31(1):46-47.
[5]孟李,王宁生.含药血清的制备方法研究[J].中药新药与临床药理,1999,10(5):290.
[6]刘国安.清热养血汤加减辨证治疗乙型肝炎150例疗效观察[J].中国医药指南,2008,6(21):107-108.
[7]何泽民,姚建华,高贵群,等.中药复方序贯治疗乙肝病毒携带者45例临床观察[J].江苏中医药,2008,40(6):42-43.
[8]唐红,赵连三,王锦容,等.利用体外细胞培养系统筛选抗HBV活性中草药的初步研究[J].中华传染病杂志,1993,4(10):22.
(收稿日期:2010-02-04)