降铅Ⅰ号对低水平铅暴露仔鼠血铅及海马一氧化氮合酶的影响
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陈 健 张 明 王晓鸣 宣桂琪 王建平
摘 要：目的：观察降铅Ⅰ号对低水平铅暴露仔鼠的血铅及学习记忆能力的影响并探讨其作用机制。方法：选用Wistar大鼠仔鼠50只，随机分成5组，每组10只，为模型组、EDTA对照组和降铅Ⅰ号低剂量、中剂量和高剂量治疗组。喂0.2％醋酸铅的去离子水造模后，每组均随机选取2只仔鼠，检测血铅及海马一氧化氮合酶NOS)活性的变化。其余仔鼠给药30天后，再检测以上指标。所有大鼠进行Y迷宫实验观察降铅Ⅰ号对铅中毒大鼠学习记忆能力的影响。结果：降铅Ⅰ号治疗30天后，各治疗组血铅水平都较模型组下降，海马NOS活性除低粥量组外，其余各组都有升高，差异有显著性(P＜0.05)。Y迷宫实验显示，降铅Ⅰ号治疗组的记忆保持率高于模型组，疗效以中、高剂量组为优，与低剂量组比较，差异也有显著性(P＜0.05)。结论：降铅Ⅰ号有较强的驱铅及改善学习记忆能力的作用。升高海马NOS活性可能是其改善学习记忆能力，减轻铅神经毒性的作用机制之一。
关键词：降铅Ⅰ号；血铅；一氧化氮合酶；学习记忆
铅是一种对人体有害的重金属元素，可对中枢神经系统产生毒性作用，引起接触者学习记忆能力的缺陷，其神经毒性越来越受到重视。目前临床采用依地酸钠钙、二巯基丁二酸钠等络合剂治疗急性重症铅中毒，其驱铅效果虽好，但存在诸多不良反应，并且也不适用于低水平铅暴露的治疗。本研究采用降铅Ⅰ号治疗低水平铅暴露大鼠仔鼠，观察其血铅、学习能力、记忆保持率及海马一氧化氮合酶(NOS)活性的变化，探讨该药对铅中毒仔鼠降铅作用、学习记忆能力的影响及作用机制，从而为临床寻求治疗铅中毒及学习障碍的有效药物提供实验依据。
1 材料和方法
1．1建立动物模型
选用健康、刚断乳的Wistar大鼠仔鼠50只，体重80―100g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，随机分成5组，每组10只，分别为模型组，EDTA对照组，降铅Ⅰ号低剂量、中剂量和高剂量治疗组。喂饲含0.2％醋酸铅的去离子水造模。各组喂饲共同配方的基础饲料，共喂饲15天。
1．2给药方法
造模结束后开始给药，EDTA对照组予CaNa2EDTA注射液10mg/(kg・d)腹腔注射；降铅Ⅰ号(由益智仁、枸杞子、牡蛎、五味子、生甘草等组成，浙江省中医院制剂室制成煎剂，再浓缩至2g生药/mL)各组给药：低剂量治疗组予降铅Ⅰ号5g(kg・d)、中剂量治疗组予10g/(kg・d)、高剂量治疗组予20g/(kg・d)稀释至相同毫升数灌胃；模型组予等量的蒸馏水灌胃。给药共30天。
1．3检测方法
1．3．1标本采集为检验造模是否成功，于造模结束并完成Y迷宫实验后，各组均随机选取2只仔鼠，用2％的戊巴比妥钠以3mL/kg的剂量腹腔注射麻醉，腹腔动脉取血1mL左右，置于加入肝素钠16μL并干燥后的离心管中，混匀。用于血铅的测定；然后将仔鼠断头处死，在冰浴中迅速分离大脑海马组织，置于-70℃冰箱冷冻备用，用于NOS的测定；给药结束后，其余仔鼠再按上述相同步骤取血，并处死取脑组织。所有容器均作无铅化处理，用5％的稀硝酸浸泡24h，再用蒸馏水洗净，烘干，标本的盛放及处理过程中尽量避免外环境的污染。
1．3．2血铅测定采用AA700型原子吸收光谱仪(美国Perkln Elmer公司)石墨炉法进行。
1．3．3 NOS活性的测定NOS测定试剂盒和双缩脲试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。将分离好的脑组织解冻，准确称重，按1：9的比例计算所需生理盐水的毫升数，在冰浴中用匀浆器制备匀浆(10％)，然后按试剂盒的要求操作测定。
1．3．4 Y速宫实验造模结束后，将大鼠置于Y迷宫中，三臂灯均亮，让其适应3min后将灯熄灭。然后打开大鼠不在的一臂灯，停留5s(灯亮臂为安全区)，将其余两臂通电(电压50V)，灯亮为随机的。记录大鼠到达安全区的时间(30s内到达有效，否则失败)，灯亮持续30s，然后熄灭，一次实验结束。两次实验之间间隔1min，直到大鼠学会为止(10次有9次正确到达安全区为学会)，记录所受电击次数。给药30天后再次检测所受电击次数，并检测记忆保持情况，即在连续10次测试中正确反应尚保持多少，以记忆保持的百分数表示。
1．4统计学方法
所有数据均输入SPSS11.O软件包中，采用均数标准差(x±s)描述，各组间采用多组单因素方差分析(One-way―ANOVA)。
2 结果
2．1 治疗前后各组血铅浓度的变化
造模结束后，随机选取的10只仔鼠血铅浓度平均为(161.13±16.94)μg/L；各组经过1个月的干预治疗后，其血铅浓度与治疗前比较。均有不同程度的下降，差异有显著性(P＜0.01)；治疗后，各治疗组与模型组比较差异也有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。但各治疗组与EDTA组及各治疗组之间比较，差异不显著(P＞0.05)。
2．2各组海马NOS活性变化
造模结束后，随机选取的10只仔鼠海马NOS活性平均为(0.79±0.56)U/mgprot；用药1月后，除低剂量组外，其余各治疗组NOS活性都有升高，前后比较差异有显著性(P＜0.05)；各治疗组与模型组比较也有显著性，其中以EDTA组上升最为明显(P＜0.01)。
2．3学习记忆能力的改善
Y迷宫实验结果提示：经过15天的低水平铅接触，各组仔鼠在Y迷宫中受电击次数无明显差别(P＞0.05)。经过1个月治疗后，EDTA对照组，降铅Ⅰ号中剂量组和高剂量组大鼠受电击次数均明显低于模型组，其记忆保持率均明显高于模型组，差异有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。降铅Ⅰ号低剂量组大鼠受电击次数与模型组比较差异不显著(P＞O.05)。学习记忆保持率以降铅Ⅰ号中、高剂量组为优，与低剂量组比较，差异也有显著性(P＜0.05)。
3 讨论
随着我国城市化和工业化进程的加快，环境铅污染日趋严重。戚其平等在2002年通过对我国9省19个城市6502名3-5岁的幼儿静脉血血铅的测定，发现其血铅总体均值为88.3μg/L，29.91％的儿童血铅水平>100pμg/L。1991年美国国家疾病控制中心(CDC)制定了新的儿童铅中毒的诊断标准为：血铅水平超过或等于100μg,/L。无论是否有相应的临床体征和其它血液生化变化。许多研究已经证实，当血铅水平超过100μg/L时将影响儿童的神经发育，影响儿童的智力和行为。因此铅中毒对儿童学习记忆能力的损害已成为现代预防医学研究的重点课题。铅中毒儿童临床常见脾气急躁、学习记忆能力下降、多动难静、盗汗、便干腹痛等症状。中医认为“铅”为阴寒之邪毒，性濡滑沉坠；内遢于肾。而“肝肾同源”肾水不足则肝阴亏损，呈现一派肝肾阴虚之象。降铅Ⅰ号以补肾益脑，柔肝解毒为组方原则，由益智仁、牡蛎、首乌、石菖蒲、五味子、白芍、生甘草等组成。整个方剂组方严谨，结合铅中毒的病因病机，标本兼顾。经临床应用，具有降低血铅水平，改善学习情况的作用心。本实验结果亦显示：降铅Ⅰ号能降低铅中毒大鼠仔鼠的血铅水平，减少受电击次数，提高记忆保持率。表明降铅Ⅰ号有较强的驱铅作用及改善学习记忆能力，减轻铅神经毒性的作用。铅可影响儿童神经系统的许多机能，但最主要影响儿童记忆功能。海马是哺乳动物学习和记忆的重要脑区。研究表明，悔马是铅损害的主要靶器官。铅对海马的神经毒性可能是通过使海马NOS活性降低及NO含量减少，从而影响大鼠长时程增强(LTP)的诱导和维持CB2a+通道的关闭和开启、谷氨酸递质的摄取与灭活来发挥作用的。NOS是催化产生内源性NO的唯一酶类。动物在学习记忆过程中，不同脑区的NO水平及NOS活力增高。当NOS缺乏时，NO产生不足，会影响长时程增强(LTP)的形成，影响正常学习记忆的获得。给大鼠注射NOS抑制剂，能使动物的空间学习记忆能力受损，其在完成迷宫任务时有遗忘表现。目前的大量研究表明，海马NOS是正常学习记忆的重要影响因素。本实验大鼠海马NO$活性测定结果表明，与模型组比较，降铅Ⅰ号中剂量组及大剂量组海马NOS的活性明显增高(P＜0.05)。提示降铅Ⅰ号能提高海马NO$活性，这可能是降铅l号能改善铅中毒鼠学习记忆能力，减轻其铅神经毒性的作用机制之一。
本实验结果还显示，与模型组比较，虽然低剂量组海马NO$的活性变化不大，其记忆保持率也能得到改善，但是这些改善明显不如中、高剂量组(P＜0.05)。并且，低剂量组大鼠在Y迷宫中受电击次数与模型组大鼠比较无差异性(P＞0.05)，提示其学习能力并未得到改善。说明海马NO$活性确是正常学习记忆的重要影响因素。但不是唯一的因素。降铅Ⅰ号对其他影响因素(如钙依赖蛋白激酶C。大脑其他部位的NOS活性等)的作用有待于进一步的实验研究。