麝香保心丸对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞增殖及氧化应激的影响

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摘要：目的 麝香保心丸对h2o2诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖活性、氧化因子丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亚基gp91、p22 mRNA表达的影响。方法 体外胶原酶消化法培养人脐静脉内皮细胞；溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）插入法测定细胞增殖活性；RT-PCR法测定NADPH氧化酶亚基gp91、p22 mRNA的表达；比色法检测细胞上清液MDA、SOD含量。结果 与对照组相比，H2O2组细胞增殖活性明显降低（P

关键词：麝香保心丸；内皮细胞；氧化应激

中图分类号：R329.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）08-0966-04

Effect of Shexiang Baoxin Pills on Cell Proliferation and Oxidative Stress Induced

by H2O2 in Human Umbilicial Vein Endothelial Cells

Ning Ruobing，Xu Changsheng，Chai Dajun，et al

Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Fujian Medical University （Fuzhou 350004）

Abstract:Objective To investigate the effect of Shexiang Baoxin pills（SBP） on cell proliferation，oxidative factor and the expression of NADPH oxidase subunit gp91，p22 mRNA in human umbilicial vein endothelial cells （HUVECs） induced by H2O2.Methods HUVECs was digested and isolated with collagenase Ⅰ and then cultured.Bromodeoxyuridine （BrdU） ELISA was used to assay proliferation of HUVEC in vitro.The expression of gp91 and p22 mRNA were detected by RT-PCR.The concentration of maleic dialdehyde（MDA） and the activity of superoxide dismutase（SOD） were assayed by colorimetric method.Results Compared with control，cell growth and proliferation was significantly lower in H2O2 group（P

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Key words:Shexiang Baoxin pills；endothelial cells；oxidative stress

血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着重要的作用。氧化应激引起的血管内皮细胞功能异常主要表现在内皮细胞炎症因子表达增加以及内皮细胞内因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH）氧化酶的激活促使活性氧离子（reactive oxygen species,ROS）的生成［1,2］。麝香保心丸作为一种用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病以及冠脉介入（PCI）术后再狭窄的有效药物，具有保护血管内皮、抑制动脉粥样硬化形成的作用，但是其相关作用机制尚未完全清楚。本研究通过观察麝香保心丸制备大鼠血清对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖活性、细胞上清液中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及细胞内NADPH氧化酶亚基gp91、p22 mRNA表达的影响，探讨麝香保心丸抗动脉硬化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 标本的采集 实验中所用脐带全部来自于福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖宫产后的新鲜胎儿脐带（孕妇自愿提供），M199培养液中4 ℃保存，2 h内进行分离培养。

1.2 主要材料和试剂 I型胶原酶（GIBCO），M199培养基（GIBCO）,胎牛血清（FBS,GIBCO），胰蛋白酶（GIBCO），PBS（北京中杉），Trizol试剂盒（Invitrogen）;RT-PCR试剂盒（Fermentas），M-MLV反转录酶、oligo（dT）15 （Promega）；Taq酶（Takara）,Marker（Ferments），引物设计、合成由上海Invitrogen公司完成；SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其他常用试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 麝香保心丸动物血清制备 称取麝香保心丸原粉0.5 g、1 g、2 g充分溶解于5 mL水中,采用灌胃法连续给药3 d，1 mL/100 g大鼠,第4天灌胃给药后4 h断头取血，3 500 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm过滤器过滤，-70 ℃保存备用,以对照组（未给药大鼠）血清为对照血清组，上述制备血药浓度为体外细胞干预10×血清，血药浓度分别为0.5 g/L、1 g/L、2 g/L，分别定为0.5 g药物血清组、1 g药物血清组、2 g药物血清组。

1.3.2 HUVEC细胞培养 无菌条件下取本院产科剖宫产分娩的新生儿脐带约15 cm，置于预先准备的装有M199培养液的无菌瓶中,按Jaffe等［3］的方法加以改进，使用0.1%I型胶原酶消化，用含20%FBS的M199培养基在37 ℃ CO2培养箱中培养。待细胞长至80%～90%汇合时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取3代～5代细胞进行实验。

1.3.3 溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）插入法检测人脐静脉内皮细胞活性 取3代～5代内皮细胞消化接种于96孔培养板中，104个细胞/孔,待其生长至70%～80%汇合时更换2%FBS培养基90 μL/well 24 h,加入含不同浓度麝香保心丸血清10 μL/well， 30 min～45 min后加入H2O2 10 μL（终浓度50 μg/mL）继续培养24 h， 加入10×BrdU 10 μL/well 37 ℃孵育2 h～3 h，弃上清,加固定液30 min，弃上清,PBS洗涤一次，加anti-BrdU-POP抗体室温60 min～90 min，弃上清,PBS洗涤3次，每次5 min，加显色底物100 μL/well 10 min～20 min，加25 μL/well 硫酸（1M）450 nm酶标仪检测其OD值，用OD值大小表示细胞活性。

1.3.4 细胞上清液中MDA、SOD的测定 参照南京建成生物工程公司试剂盒说明，将各种试剂按要求混合摇匀。取各组细胞的培养液，加入混合试剂。旋涡混合器混匀，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷却，使用分光光度计测各管吸光度值。按照试剂盒说明计算MDA和SOD的含量。

1.3.5 RT-PCR法测定NADPH氧化酶亚基gp91、p22 mRNA表达水平 按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA；取各组细胞RNA 1 μg根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再取逆转录产物1 μL进行PCR扩增。引物序列及扩增条件； GADPH：上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′；gp91：上游:5′-ACA AGG TTT ATG ACG ATG AGC CTA-3′，下游:5′-CAC TGG CAG CAA GAT CAG CA-3′；p22：上游5′-ACC GTC TGC TTG GCC ATT G-3′，下游5′-TCA ATG GGA GTC CAC TGC TCA C-3′。PCR扩增反应体系：Premix Taq 12.5 μL，cDNA 4 μL，上下游引物各2 μL（浓度为10 μmoL/L），加无核水至终体积25 μL。PCR扩增参数：预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环（GADPH为30个循环）；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR反应产物，加入6×溴酚蓝上样缓冲液1 μL，混合后，于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为8 V/cm，电泳45 min～60 min，使用凝胶成像分析系统进行观察并拍摄电泳图像，分析产物的IOD值（即各电泳条带之光密度积分值），以GADPH作为内参照，进行PCR产物的半定量分析，比值表示其相对含量。

1.4 统计学处理 所有数据以均数±标准差（x±s） 表示；采用 SPSS 13.0软件包统计；多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；P

2 结 果

2.1 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞增殖的影响 与对照组相比，H2O2组细胞活性明显降低（P

表1 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导

HUVEC细胞增殖的影响（x±s）

2.2 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞上清液MDA水平及SOD活性的影响 与对照组相比，H2O2显著升高HUVEC细胞上清液MDA水平，明显降低HUVEC细胞上清液SOD活性（P

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表2 各组SOD活性以及MDA含量比较（x±s）

2.3 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞gp91 mRNA表达水平的影响 与对照组相比，H2O2组gp91 mRNA表达无统计学意义。与H2O2组相比，对照血清组及麝香保心丸药物血清组gp91 mRNA的表达无统计学意义（P>0.05）。详见图1、表3。

注：M、1、2、3、4、5、6分别为Marker、对照组、H2O2组、对照血清组、0.5g药物血清组、1 g药物血清组、2 g药物血清组。

图1 各组H2O2诱导HUVEC细胞gp91 mRNA表达

表3 各组H2O2诱导HUVEC细胞gp91 mRNA表达（x±s）

2.4 麝香保心丸药物血清对H2O2诱导HUVEC细胞p22 mRNA表达水平的影响 与对照组相比，H2O2组p22 mRNA表达明显升高，对照血清组p22 mRNA进一步增加；与对照血清组相比，0.5 g、1 g药物血清组无明显差异，而2 g药物血清组p22 mRNA的表达显著降低（P

注：M、1、2、3、4、5、6分别为Marker、对照组、H2O2组、对照血清组、0.5 g药物血清组、1 g药物血清组、 2 g药物血清组。

图2 各组H2O2诱导HUVEC细胞p22 mRNA表达

表4 各组H2O2诱导HUVEC细胞p22 mRNA表达（x±s）

3 讨 论

Harman于1956年最早提出了氧自由基（ROS）的基本理论［4］，1969年McCord和Fridovich发现了能将ROS清除的SOD［5］，随后以氧化应激为核心的自由基理论一直是生物医学界研究的热点。氧化应激参与血管内皮细胞病理生理变化过程的各个环节，血管内皮细胞氧化应激损伤也是动脉粥样硬化病变的基础［6］。已有研究证实，动脉粥样硬化的危险因素如高血脂、高血糖等均能引起血管内皮氧化应激损伤［1,2］。血管内皮细胞受到氧化应激损伤后可表现为细胞活性降低，增殖受到抑制。细胞内相应的自由基类如MDA明显增多，过多的自由基类物质可导致机体的损伤。而SOD能消除人体内多余的自由基，从而保护细胞不受毒性氧自由基损伤。在生理状态下，氧化与抗氧化处于平衡状态，当危险因素水平升高时，可出现氧化抗氧化失衡，氧化应激损伤，抗氧化能力下降，引发动脉粥样硬化的发生发展。本研究结果发现H2O2引起内皮细胞氧化应激损伤，麝香保心丸能抑制H2O2诱导的内皮细胞氧化应激，并提高细胞增殖活性。

麝香保心丸由麝香、人参提取物、苏合香、牛黄、蟾酥、肉桂、冰片等中药组成， 长期以来作为一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的有效药物， 临床上已得到广泛应用。它能有效缓解心绞痛症状、明显改善缺血性心电图的表现，治疗心肌缺血效果显著［7］。麝香保心丸也能通过保护血管内皮、抑制炎症等途径促进血管新生［8］。本研究采用H2O2制作血管内皮细胞氧化应激损伤模型，来研究麝香保心丸对于内皮细胞氧化应激损伤的影响及其机制。结果发现，麝香保心丸药物血清呈浓度依赖性减轻H2O2引起的内皮细胞损伤。

内皮细胞中的活性氧来源于线粒体电子传递链、一氧化氮合酶（NOS）、NADPH氧化酶等多种途径。多项研究证实NADPH氧化酶是生理条件下产生ROS最主要的来源［9］。NADPH 氧化酶首先在吞噬细胞中被发现，其催化亚基gp91phox（NOX2）和调节亚基p22phox在细胞膜上形成异二聚体（即黄素细胞色素b558），一些主要位于胞浆的分子（p47phox，p67phox及Rac蛋白）也可对其进行调节［10，11］。内皮细胞损伤是心血管性疾病的关键环节。同型半胱氨酸（Hcy）调控NADPH氧化酶活性而引起ROS水平升高的直接作用是使NO舒血管作用丧失,导致内皮功能障碍。在血管内皮细胞中,发现高浓度的Hcy可以刺激NADPH氧化酶的活化和p22phox 表达的升高［12］。在本实验中H2O2能引起NADPH氧化酶p22 mRNA表达增加，对照血清组p22 mRNA表达进一步增加;与对照血清组相比，麝香保心丸0.5 g、1 g药物血清组无明显差别，而麝香保心丸2 g药物血清组p22 mRNA的表达显著降低。H2O2与麝香保心丸血清对于内皮细胞NADPH氧化酶亚基gp91 mRNA的表达无明显影响，提示H2O2对内皮细胞引起的氧化应激损伤可能是通过影响调节亚基p22而非催化亚基gp91的活性，进而引起ROS生成增多以及一系列相关的作用。然而本实验与临床仍有不少距离，尚需做动物模型实验以作进一步探讨。

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作者简介：宁若冰（1985―），男，现为福建医科大学附属第一医院心血管内科在读博士研究生（邮编:350004）；许昌声、柴大军、林金秀（通讯作者），工作于福建医科大学附属第一医院（邮编:350004）。

（收稿日期：2011-02-16）

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