光损伤大鼠视网膜TNF―α的表达变化及米诺环素对其表达影响的实验研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇光损伤大鼠视网膜TNF―α的表达变化及米诺环素对其表达影响的实验研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘 要】目的：观察光损伤大鼠视网膜肿瘤坏死因子（tnf）-α表达变化的规律，及预先使用米诺环素（Minocycline，MC）对其分泌表达的影响，探讨视网膜光损伤的损伤机制和防治措施。方法：54只SD大鼠，随机分为光照对照组、光照实验组、正常对照组，前两组再各分为光照后6h、3d、7d、14d组，每组各6只大鼠（12只眼）。光照前90min，光照实验组大鼠MC灌胃（45mg/kg），光照对照组大鼠等量PBS液灌胃。分别于预定时间点取眼球，左眼石蜡包埋、HE染色、TNF-α免疫组化染色，计算机图像分析软件（Image-Pro Plus，IPP）测量视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）厚度。右眼球摘除后即刻完整取出视网膜，匀浆后取上清液，ELISA法测定TNF-α的吸光度（O.D）值并计算出TNF-α浓度。SPSS行统计分析。结果：1，正常对照大鼠视网膜形态正常，TNF-α未见阳性染色，ELISA定量仅含微量。2，光照对照组视网膜6h即出现病理改变，3d和7d进行性加重，14d略有减轻。视网膜TNF-a阳性表达6h开始增加，3d显著增加，7d减少，14d进一步减少，ELISA定量结果和免疫组化结果相平行。各时间点ONL厚度、TNF-a表达量和正常对照组相比，P值均
【关键词】视网膜光损伤；米诺环素；免疫组织化学
视网膜光损伤发病机制和药物防治的研究是最近几十年来眼科领域一个基础结合临床的重要课题，其中光化学损伤最常见。特别是近年来，各种眼科光学诊疗器械光源所致视网膜损伤等问题已越来越引起人们的注意，视网膜光化学损伤还是视网膜变性类疾病的良好动物模型，其病理过程与年龄相关性黄斑变性及视网膜色素变性有许多相似之处[1]，而这两种疾病到目前为止尚无有效的防治方法。所以对视网膜光化学损伤的继续深入研究有着重要的理论和临床实用价值。本实验意在探讨视网膜光损伤的发病机制，及为其有效防治提供实验依据。
1材料和方法
1.1实验动物及分组 健康雌性SD大鼠54只（8～10周），体重200±20g，检查无眼疾。随机分为光照对照组（PBS灌胃）、光照实验组（MC灌胃）和正常对照组，前两组再分别分为光照后6h、3d、7d、14d组，每组分别6只大鼠（12只眼）。
1.2光损伤建模 采用自制光损伤装置（1m×1m×1m）（图1，图2）。所有实验用大鼠（包括正常对照组）均于光照前暗适应24小时。光照前90分钟，光照实验组大鼠0.5%MC溶液灌胃（9ml/kg/只），光照对照组大鼠等量PBS溶液灌胃。正常对照组大鼠未予任何处理。用光照强度为1737.9±393.0lux的绿色荧光灯作为致伤光源，连续照射36小时。光照结束后送回暗环境饲养。
1.3组织标本的获取 预定时间点，3%戊巴比妥钠按1ml/kg腹腔内注射麻醉，迅速摘除双侧眼球（包括球后视神经约3mm）。追加3%戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠。右眼球立即放入盛有PBS液的玻璃皿中，双目立体显微镜下完整取出视网膜并用PBS液再次冲洗，立即称取湿重后，按重量体积比1：2加入样品稀释液，低温下研磨匀浆视网膜后，移入离心管中，低温离心机， 10000rpm、4℃下离心20min。收集全部上清液，-20℃备用做ELISA检测。左眼球立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定48小时后，去除眼前节和玻璃体，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视颞侧旁1mm纵向做切片。
1.4检测指标及方法 ⑴视网膜TNF-αELISA检测；⑵常规HE染色；⑶TNF-α免疫组化。
1.5结构改变，并测量光照对照组、光照实验组各时间点和正常对照组ONL厚度，求其均值代表这张图片ONL的厚度，并以此作为视网膜光感受器最终丧失的判断指标。各指标以均数±标准差（X±SD）表示）。光镜下比较、分析TNF-α免疫组化切片的染色动态变化及定性、定位变化。用SPSS 15.0 For Windowss进行统计分析。统计方法：各组各时间点的比较用单因素方差分析，光照组和正常对照组之间的两两比较及两组同一时间点比较采用配对t检验，P
2结果
2.1病理改变特点
2.1.1各组视网膜光镜下组织形态和ONL厚度的特点（LM×200）：
（1）正常SD大鼠：视网膜形态正常，结构层次分明，ONL厚度为46.36±3.06μm。（图3）（2）光照对照组大鼠：光照后6小时即已发生外层视网膜损伤，3天和7天，外层视网膜损伤进行性加重，7天时，光感受器细胞内外节可见大的空泡形成，内外节变短，ONL细胞核进一步减少，、排列紊乱， ONL厚度28.38±2.29μm，较正常减少38.78%（图4）。14天开始有所修复。
（2）光照实验组大鼠：光照后6小时仅见外节结构轻度紊乱，3天和7天，视网膜损伤也呈进行性加重， 但较光照对照同期组视网膜外层损害均明显为轻。7天时，外节空泡较前增多增大，内外节分界欠清晰，内外节变短，ONL厚度36.04±2.03μm，较正常减少22.26%（图5）。14天较明显修复。
2.1.2 光照前后视网膜ONL厚度改变的统计学分析：如表1和图6示，光照对照组各时间点ONL厚度和正常对照组相比，差别均有统计学意义，P
2.2 视网膜TNF-α的表达变化
2.2.1 免疫组织化学结果（IHC×200） ⑴正常对照组视网膜全层均未见TNF-α阳性染色（图7）。⑵光照对照组各时间点视网膜：6h视网膜全层已出现TNF-α棕黄色阳性颗粒，但染色较浅。3d视网膜全层TNF-α棕黄色颗粒强阳性染色达峰值（图8）。7d和14d视网膜阳性染色进行性消退。⑶光照实验组各时间点视网膜：6h内层视网膜、外丛状层（outer plexiform layer，OPL）和ONL内侧份出现染色较浅的棕黄色阳性颗粒。3d全层视网膜棕黄色阳性染色达本组峰值，但染色强度明显较光照对照3d组为弱（图9）。光照实验组7d和14d视网膜阳性染色进行性消退，14d时已完全消退。
2.2.2 ELISA定量检测 将零孔作为对照，画出标准曲线，从而计算出各样品的浓度。由于样品用样品稀释液稀释了2倍，所以其实际浓度×2，得出各组各时间点大鼠视网膜内TNF-α含量如表2和图10所示。正常视网膜组织仅含微量TNF-α，38.75±7.83 pg/ml。光照对照组光照后6小时视网膜组织内TNF-α开始增多，3天显著增多，以后逐渐减少，但光照后各观察时间点和正常对照组相比，差别都有统计学意义（P0.05）。光照对照组和光照实验组各相同时间点两两比较，差别都有统计学意义（P
3讨论
本实验利用光照强度1737.9±393.0lux的绿色荧光灯为致伤光源，采用连续光照36小时的方法，成功制作了SD大鼠的视网膜光化学损伤动物模型。本实验致伤光源采用波长为510～560nm 的绿光， 这是参考了谢伯林等[2]的光损伤的成功模型。
由于视网膜光损伤主要表现在视细胞，测量视网膜ONL厚度可以比较直观地反映视细胞损伤的程度，因此本实验以视网膜ONL厚度为主要观察指标之一，结合视网膜HE切片光镜下观察视网膜组织病理学的改变，来评估视网膜光损伤的程度。实验中观察到，光照后各个观察时间点均出现了视网膜组织的病理改变且呈动态变化，光镜下主要为：内外节结构紊乱，分界不清，ONL细胞核间隙增大，感光细胞核排列不规则且稀疏，ONL变薄。光照后6h已出现上述病理改变，3d加重，73损伤最重，14天时略有好转。光照后各个时间点ONL厚度和正常大鼠视网膜ONL厚度相比，差别均有统计学意义（P
MC又称美满霉素，为半合成四环素类广谱抗生素，通过干扰细菌蛋白的合成而发挥抗菌作用，但近年多项研究表明，在许多CNS疾病，如脑缺血、脑外伤、多发性硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病等动物模型上，米诺环素均发挥了显著的神经保护作用，即与其抗微生物活性完全不同的抗凋亡活性[3-4]。比如米诺环素在成年动物的脑缺血损伤模型中显示了神经保护作用，在无论局灶性还是全脑性缺血的模型中，通过米诺环素全身给药显著抑制了小胶质细胞的活性，减轻了炎症反应，缩小了梗死面积，提示MC的神经保护作用和抑制小胶质细胞的过度活化有关。米诺环素在四环素类中亲脂性最高，全身给药可通过血脑屏障。而视网膜是中枢神经系统的外延部分，因而我们推断米诺环素全身给药也可通过血视网膜屏障，在视网膜光化学损伤等眼底病变中发挥神经保护作用。米诺环素口服可迅速、几近完全吸收，几乎不受食物的影响，1～2小时即达血药峰值，血浆半衰期为12～18小时，因此本实验设计了光照前90分钟MC灌胃途径给药的方法。剂量的选择（45mg/kg）则基于脑损伤的不同实验模型中报道的有保护作用的剂量[5]。
实验中观察到，MC灌胃组大鼠光照后各观察时间点也都出现了视网膜组织的损伤变化，但都较PBS灌胃组同一观察时间点的视网膜损伤为轻，各同一时间点ONL厚度比较，差别都有有统计学意义。而光照实验组光照后各观察时间点ONL厚度和正常对照组比较，除14d组外，余各组差别都有统计学意义，14d组和正常对照组相比则无明显差别（P>0.05）。说明光照前全身预防性应用米诺环素，视网膜组织损伤轻、恢复快，明显减少了感光细胞的丢失，对大鼠视网膜光损伤发挥了有效的神经保护作用。这也证明了米诺环素可以通过血视网膜屏障。
TNF-α是主要由巨噬细胞和活化的单核细胞分泌的前炎性细胞因子，对机体发挥“双刃剑”作用，低水平时参与机体的免疫防御，高水平时会给机体造成严重损害，在诸多眼病的发生发展中起着重要介质作用。本实验观察了各组大鼠视网膜中TNF-α的动态表达变化，取材分别来自同一大鼠的左右眼，采用免疫组织化学定位、定性和ELISA定量观察相结合的方法。实验中观察到，正常对照组大鼠视网膜形态、结构均未发现异常，ELISA定量检测发现含微量 TNF-α，说明其是视网膜实现正常的生理功能所必需， 对维持视网膜组织的稳定状态和抵制各种致病因子具有重要意义。光照后6h迅速增多，3d达最大值，为896.65±19.21pg/ml，而HE染色光镜下观察视网膜损伤最重是在光照后7d，出现在视网膜TNF-α表达达峰值之后，这提示TNF-α参与并加重了视网膜光损伤。视网膜TNF-α含量7d和14d逐渐减少，但仍维持在一个较高的水平，14d时下降为120.40±9.35pg/ml。上述光照对照组光照后各时间点视网膜TNF-α含量和正常对照组比较，差别均有统计学意义。而光照实验组光照后各时间点视网膜TNF-α含量也呈相似的动态变化，但表达量均较相同时间点光照对照组低得多，同一时间点两两比较，差别均有统计学意义。说明预防性使用MC明显抑制了光损伤后视网膜TNF-α的表达。光照后14d，光照实验组视网膜TNF-α含量已下降到接近正常对照组水平，两者差别无统计学意义，同时反映视网膜组织损伤程度的ONL厚度也无明显差别，这就进一步说明TNF-α参与了视网膜光损伤的病理过程，视网膜TNF-α含量和视网膜光损伤程度密切相关，含量的多少直接影响到视网膜损伤程度的大小，当TNF-α含量下降到接近正常水平时，视网膜损伤停止，并以较快的速度完成形态学的修复。所以笔者认为，视网膜光损伤时TNF-α过度分泌，通过诱导感光细胞的凋亡参与并加重了视网膜光损伤的病理过程。而预防性使用米诺环素，视网膜损伤减轻而且修复较快，同时TNF-α在视网膜表达明显减少，看来抑制TNF-α的过度分泌是米诺环素发挥神经保护作用的重要机制之一。
TNF-α主要来自单核巨噬细胞系统，而CNS和视网膜中固有的巨噬细胞是神经胶质细胞中的小胶质细胞[6]，故CNS和视网膜病理损伤时表达增加的TNF-α主要由小胶质细胞分泌， TNF-α被称为“小胶质细胞源性毒性细胞因子”之一。已有多项研究发现，米诺环素是中枢神经系统小胶质细胞的抑制剂[7]，但尚未发现对其他细胞有抑制作用。所以本实验条件下，小胶质细胞是光损伤后视网膜TNF-α的主要分泌细胞。视网膜光损伤中米诺环素通过抑制小胶质细胞的过度活化，减少了TNF-α的过多分泌表达，从而发挥了抗凋亡活性。米诺环素还有无其他可能发挥保护作用的机制还有待进一步的研究。
参考文献：
[1] Hafezi F，Marti A， Munz Keral. Light-induced apoptosis：differential timing in the retinal and pigment epigment epithelium.Exp Eye Res，1997，64：963-970.
[2] 谢伯林，严密，张军军等.绿色荧光灯对大鼠视网膜光化学损伤的动态观察.中华眼底病杂志，1998，14（2）：101-103.
[3] Gaur U，Aggarwal BB.Regulation of proliferation，survival and apoptosis by members of the TNF superfamily [J]. Bio-chemPharmacol，2003，66：1403-1408.
[4] 王爱玲，吴玲玲.视网膜小胶质细胞与眼科疾病.国外医学眼科学分册，2004，28（6）：418～421.
[5] Arvin KL， Han BH， Du Y， et al.Minocycline markedly protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury. Ann Neurol ，2002，52：5461.
[6] Hui-yang Zeng， Xiu-an Zhu， Cheng Zhang， et al. Identification of Sequential Events and Factors Associated with Microglial Activation， Migration， and Cytotoxicity in Retinal Degeneration in rd Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2005， 46（8）： 2992-9.
[7] Du Chu Wu， Vernice Jackson-Lewis，Miquel Vila，et al. Blockade of Microglial Activation Is Neuroprotective in the 1-Methy l-4-Phenyl -1，2，3，6 Tetrahy -dropyridine Mouse Model of Parkinson Disease. The Journal of Neuroscience， 2002， 22（5）：176371.