氯法拉滨注射液的细菌内毒素检查

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[摘要] 目的:建立氯法拉滨注射液中细菌内毒素的检查方法。方法:利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的原理对氯法拉滨注射液中的细菌内毒素进行检查。结果:氯法拉滨注射液在浓度为0.05～0.50 mg/ml对测定均无干扰作用,限度确定为每毫克氯法拉滨中含内毒素的量应小于2.5 EU。结论:氯法拉滨注射液中的细菌内毒素检查可用鲎试验法,此法灵敏可靠,方便经济。

[关键词] 干扰试验;细菌内毒素;氯法拉滨注射液

[中图分类号]R927.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)01(c)-052-02

Test on bacterial endotoxin in Clofarabine Injection

HAN Jiyong, BAO Xiaoli, CHEN Xiangfeng

(Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing 211112, China)

[Abstract] Objective: To establish the determination method of bacterial endotoxin in clofarabin Injection. Methods: Clofarabin injection was examined by principle of TAL and bacterial endotoxin response through cohesion. Results: The sample was diluted to 0.05-0.50 mg/ml without confusion and the limit of bacterial endotoxin should be lower than 2.5 EU/mg. Conclusion: Bacterial endotoxin test is accurate and suitable for the detection of bacterial endotoxin in clofarabin injection.

[Key words] Interfere factors; Bacterial endotoxin; Clofarabine Injection

氯法拉滨(clofarabine,商品名:Clolar)是第二代嘌呤核苷酸类似物,由美国Genzyme公司研发,2004年12月28日美国FDA快速审评并批准其用于治疗儿童难治性或复发性急性淋巴细胞白血病(ALL),患者此前至少已接受2种疗法治疗而无效者。作为目前唯一可以特异性用于儿童白血病的化疗药,其治疗白血病总缓解率高,且耐受好,无不可预知的不良反应[1-2]。氯法拉滨注射液作为静脉注射用制剂,应严格控制细菌内毒素的含量,目前尚无相关报道,本文参照相关药品的内毒素检查法[3],建立了采用鲎试剂测定氯法拉滨细菌内毒素含量的方法,为建立药品质量标准,提供了试验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZH-2型自动漩涡混合器,天津药典标准仪器厂;DC-3A型细菌内毒素检查干式恒温器,南京三爱斯技术开发有限公司。

1.2 试药

鲎试剂(TAL,批号:0811242,灵敏度:0.125 EU/ml,规格:0.1 ml/支,湛江安度斯生物有限公司);鲎试剂(TAL,批号:07030312,灵敏度:0.125 EU/ml,规格:0.1 ml/支,福州新北生物工业有限公司);细菌内毒素工作标准品(CSE,批号:150601-200861,规格:150 EU/支,中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(BET水,批号:200804,规格:10 ml/支,中国药品生物制品检定所);氯法拉滨注射液(批号:070301,070302,070303;规格:20 ml∶20 mg,江苏奥赛康药业有限公司药物研究所)。整个试验过程应严格遵守无菌操作规程,所用器皿无热原,保证无外源性物质干扰[4-5]。

2 方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度的复核

按照《中国药典》2005年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法操作[6],用BET水将CSE稀释制成2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ系列浓度后进行试验,结果鲎试剂的复核灵敏度Cλ均为0.5 λ～2.0 λ,符合规定。

2.2 细菌内毒素限值(L)的确定

根据公式L=K/M,静脉给药时K=5 EU/(kg・h)。本品用于儿童,儿科推荐剂量为52 mg/m2,2 h内用完[7],儿童年龄、体重跨度较大,按新生儿的体重为3 kg,体表面积为0.21 m2计算[8],儿童的推荐剂量M为1.82 mg/(kg・h)。细菌内毒素限值L=5[EU/(kg・h)]/1.82[mg/(kg・h)]=2.75 EU/mg,为方便操作,将本品的细菌内毒素限度调整为每毫克氯法拉滨中含内毒素的含量应小于2.5 EU。

2.3 干扰试验预试验

根据最大有效稀释倍数MVD =cL/λ,c为氯法拉滨注射液浓度,为1.00 mg/ml,可计算出本品MVD为20倍,即最小有效检测浓度为0.05 mg/ml。用BET水将氯法拉滨注射液稀释成0.50、0.40、0.20、0.10和0.05 mg/ml的溶液(记为NPC管);另制备同样浓度系列的供试品溶液,并且每个浓度含2 λ的细菌内毒素(记为PPC管)。取两个不同厂家的鲎试剂若干,分别加0.1 ml BET水复溶,再分别加入各溶液0.1 ml,同时设阴性对照管(NC)和阳性对照管(PC),每管均平行2份,轻轻混匀,封口,在37 ℃保温60 min,结果表明氯法拉滨注射液在浓度为0.05～0.50 mg/ml范围内,对试验均无干扰,见表1。

2.4 正式干扰试验

用BET水和0.5 mg/ml的供试品溶液,分别将同一支细菌内毒素工作标准品稀释成2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ 4个浓度的溶液,再取鲎试剂36支,分别用0.1 ml BET水溶解后,加入各浓度稀释液0.1 ml,每稀释度做4管,同时做检查用水阴性对照2管和样品阴性对照2管,37℃保温60 min后观察,结果表明供试品在此浓度下,对细菌内毒素检查法无干扰作用,见表2。

2.5 供试品细菌内毒素检查

取供试品溶液,用BET水稀释成0.5 mg/ml的供试品溶液,以灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂依法检查,结果氯法拉滨注射液的细菌内毒素检查结果均小于2.5 EU/mg,见表3。

表 3 氯法拉滨注射液细菌内毒素检查结果

3 讨论

通过干扰性预试验筛选出不干扰鲎试剂与内毒素凝聚反应的氯法拉滨注射液浓度范围,大大减少供试品检验时的盲目性。

采用0.5 mg/ml的供试品溶液进行正式干扰试验,结果表明Es为0.5 λ～2.0 λ,且Et在(0.5～2.0)Es,说明在此浓度下无干扰作用。

按儿童用药剂量的3倍,作为热原检查时家兔的给药剂量,即5.46 mg/kg,对3批氯法拉滨注射液进行热原检查,结果均符合规定,表明内毒素检查和热原检查均可用于氯法拉滨注射液的质量控制。由于凝胶法检查细菌内毒素操作简便,快速,因此建议质量标准中采用细菌内毒素控制本品的质量。

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[2]夏敏,蒋慧.儿童急性白血病治疗新药氯法拉滨[J].世界临床药物,2007,28(6):356-359.

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(收稿日期:2009-07-21)