外翻肠囊吸收成分与药效相关研究吴茱萸汤治疗偏头痛的药效物质
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[摘要] 吴茱萸汤是治疗虚寒性偏头痛的经典方剂，其与偏头痛治疗相关的有效成分尚不明确。该实验采用大鼠外翻肠囊模型获取10种吴茱萸汤的吸收样品，以 HPLC-DAD对吴茱萸汤及外翻肠囊吸收样品中9种成分进行定量、半定量，得到各成分在汤中的含量及在肠囊中的累积吸收量。同时建立利血平化小鼠偏头痛动物模型，在给予吴茱萸汤治疗后测定脑组织内5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），去甲肾上腺素（noradrenaline，NE），多巴胺（dopamine，DA）及脑组织与血清内一氧化氮（nitric oxide，NO）及其合成酶（nitricoxide synthase，NOS）的含量与活力。最后运用偏最小二乘回归法（partial least squares regression，PLSR）对各成分总吸收量与药效指标进行相关分析，发现了外翻肠囊吸收成分中影响药效的主要成分是柠檬黄素-3-O-β-D-葡萄糖苷（limocitrin-3-O-β-D-glucoside，Lcs），人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，Rg1），人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，Rb1）、吴茱萸苦素（rutaevine，Rv）、柠檬苦素（limonin，Li）、吴茱萸碱（evodiamine，Ev）及吴茱萸次碱（rutaecarpine，Ru），其中Rg1，Rv，Ev及Ru对多数药效指标具有正向改善作用，可能是影响吴茱萸汤治疗偏头痛作用的主要成分。
[关键词] 吴茱萸汤；偏头痛；外翻肠囊吸收谱效相关；偏最小二乘回归；药效物质
[收稿日期] 2013-08-17
[基金项目] 北京市教育委员会科技计划面上项目（SQKM201210025011）；首都中医药研究专项重点课题项目（13ZY02）
[通信作者] *龚慕辛，博士，博士生导师，从事中药复方物质基础研究，Tel：（010）83911632，E-mail：
[作者简介] 潘学强，硕士研究生，E-mail：
吴茱萸汤出自《伤寒论》，现代临床上主要用于治疗多种头痛[1]。全方由吴茱萸、生姜、人参及大枣4味中药组成。曾有学者采用化学分析与药理相结合的方法对其药效物质进行研究[2-3]，但由于缺乏成分分析与治疗偏头痛相关药效指标的关联，使其有效成分尚不明确，影响了质量控制与治疗作用的优化。本实验将10种吴茱萸汤中的9种成分在外翻肠囊的累积吸收量与偏头痛药效指标相关联，采用PLSR进行分析，并与吴茱萸汤谱效相关结果进行对比，以发现吴茱萸汤吸收成分中影响药效的主要成分，为其治疗偏头痛的药效物质研究提供参考。
1 材料
ALC-M组织-器官恒温水浴系统（上海奥尔科特生物技术有限公司）；Agilent 1100系列高效液相色谱系统，Chemstation色谱工作站，含四元泵、自动进样器、DAD检测器（Agilent公司）；ESA高效液相色谱系统，Coularry 工作站，含二元泵，自动进样器，电化学检测器（ESA公司）；MG-2200氮吹仪（EYELA公司）；Silent Crusher M匀浆仪（ Heidolph公司）；3K15低温高速离心机（Sigma公司）；UV-2450紫外可见分光光度计（SHIMADZU公司）；SpectraMax Plus 384酶联免疫检测仪（Molecular Devices公司）；DV215CD电子分析天平（Sartorius公司）；KQ-250超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
利血平注射液（广东邦民制药厂有限公司，批号100509）；琥珀酸舒马普坦片（天津华津制药有限公司，批号2F69151）；注射用青霉素钠（中诺药业有限公司，批号016110691）；NO测定试剂盒（批号20130206），NOS测定试剂盒（批号20130228），考马斯亮蓝试剂盒（批号20130216），均购自南京建成生物工程研究所；吴茱萸碱（批号110801-200908，纯度99.7%），吴茱萸次碱（批号110801-201207，纯度99.4%），柠檬苦素（批号110800-201205，纯度88.5%），人参皂苷Rg1（批号110703-201128，纯度93.4%），人参皂苷Re（批号110754-201123，纯度89.1%），人参皂苷Rb1（批号110704-201223，纯度95.9%），6-姜辣素（批号111833-201102，纯度98.6%）对照品购自中国食品药品检定研究院；柠檬黄素-3-O-β-D-葡萄糖苷（自制，纯度≥95%）；5-HT（批号N-5785-250MG），DA（批号H8502-5G），NE（批号H7752-250MG），3，4-二羟基苄胺（3，4-dihydroxybenzylamine，3，4-DHBA，批号16290-26-9，纯度98%）对照品及内标物购自Sigma公司；乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯）购自Fisher公司。
Wistar大鼠，雄性，体重（300±20） g；ICR小鼠，雌雄各半，体重（30±2） g，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京） 2012-0001。
2 方法
2.1 吴茱萸汤样品的制备
饮片来源及编号详见表1。各饮片由首都医科大学中医药学院罗容教授鉴定，符合《中国药典》（2010年）各药项下规定。各药味配伍见表2，按照文献方法[4]进行煎煮，药液减压干燥成干膏，复溶后测定其中9种成分含量。
Table 6 Contents and activities of monoamine neurotransmitters and NO and NOS in mice（±s，n=12）
注：与正常对照组比较1）P
表7 药效指标与外翻肠囊总吸收量的偏最小二乘回归分析结果
Table 7 Result of PLSR analysis between the values of pharmacodynamic indexes and total absorption quantities
注：1）表示该成分对相应指标影响正向作用排前3位，2）表示该成分对相应指标影响负向作用排前3位。
3.4.2 吴茱萸汤中成分与外翻肠囊累积吸收量的偏最小二乘回归 结果见表8。结果中系数为正表示吴茱萸汤中成分含量越高外翻肠囊总吸收量越大，负数反之。
4 讨论
4.1 主要药效成分的药理作用
本实验发现Lcs，Rg1，Rb1，Rv，Li，Ev，Ru与药效指标回归系数绝对值较大，对多种药效指标具有显著的调节作用，因此可能是吸收成分中影响药效的主要药效成分。前人对上述成分的药理作用进行了深入的研究，结果表明Rg1能够保护DA能神经元[8]，并能提高心肌组织NO水平，促进心肌血管再生[9]。Rb1能与中枢单胺能神经相互作用，升高5-HT等神经递质含量[10]，同时可通过下调NO含量发挥抗氧化应激的作用[11]。Li具有显著的神经保护作用[12]，能够抑制钙内流及NO的过度生成[13]，但是否能够升高5-HT含量未见报道。Ev可促进儿茶酚胺类物质的分泌[14]，剂量依赖的抑制单胺氧化酶活性[15]，通过上述2种作用增加模型小鼠脑内5-HT及NE含量；同时Ev是辣椒素受体（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）的激动剂，通过激活该受体，促进小鼠主动脉及离体内皮细胞的内皮型NOS磷酸化，进而诱导NO的产生[16]；Ru具有促进儿茶酚胺类物质的分泌的作用[17]。上述药理作用可能是各成分在本实验中对不同药效指标显示正向作用的基础。本实验结果还显示Lcs及Rv对所有指标均有较显著的调节作用，而目前对Lcs活性的研究尚未见报道，Rv仅见对其抗氧化活性的研究[18]，本实验结果为2种成分今后的药理研究提供了参考。总之，结果显示吴茱萸汤多种成分对同一指标，同一成分对多种指标都存在作用，提示吴茱萸汤治疗作用的优化需要对汤中有关成分含量及相互间比例进行控制。
表8 吴茱萸汤中各成分与外翻肠囊中相应成分总吸收量的偏最小二乘回归分析
Table 8 Result of PLSR analysis between the contents of ingredients in Wuzhuyu Tang and its′ total absorption quantities in everted intestine sacs
4.2 外翻肠囊吸收谱效相关
外翻肠囊法是一种经典的研究药物吸收的体外方法，其吸收结果与体内药物吸收水平接近，吸收成分种类远远少于汤中成分，因此与药物谱效相关分析相比，外翻肠囊法更加注重药物与机体的相互作用，且结果分析难度低；药物成分在外翻肠囊中主要为累积吸收，极少受分布与代谢的影响，有效避免了血清指纹谱-效相关中需要分析指纹谱中谱峰的动力学过程与药效作用关系的复杂工作以及对检测条件的高要求，给谱效相关研究提供了可行的方法。前期研究已经证实吴茱萸汤外翻肠囊吸收成分与入血成分存在较好的对应关系，可替代入血成分分析[5，19-20]。本实验首次将外翻肠囊累积吸收量与药效实验结果联系起来，目的是模拟药物体内过程进行吸收谱效相关，根据表7中结果（回归系数的正负与大小）直观发现化学成分与偏头痛药效指标的关系，从而快速发现药效物质。
4.3 外翻肠囊吸收谱效相关结果的可信性验证
课题组曾建立了吴茱萸汤特征图谱，在获得了10种吴茱萸汤中成分含量后，将其与药效进行了谱效相关分析（即药物谱效相关），结果发现Rg1，Re，Rb1，Rv，Li，Ev，Ru及未知物质X含量与药效指标回归系数较大，为影响药效的主要成分，其中Rb1，Rv，Ev，Ru是主要的正向作用成分。本实验结果显示汤中未知物质X未吸收入肠，而吸收成分中Lcs，Rg1，Rb1，Rv，Li，Ev，Ru与药效指标回归系数较大，为影响药效的主要成分，其中Rg1，Rv，Ev及Ru为主要的正向作用成分。两者比较，影响药效的主要成分除Lcs及Re外均相同，正向作用成分4种中有三者相同。根据药物谱效、吸收谱效的相关分析结果，结合表8汤中成分含量对吸收总量的影响，按成分含量高低检索10种吴茱萸汤，均发现5号汤与8号汤各成分含量较符合筛选结果，药效实验结果显示此二组指标改善作用较好，说明2种方法结果一致，本实验采用的外翻肠囊吸收谱效相关分析在中药复方药效物质发现方面是可行的。
4.4 外翻肠囊吸收谱效与药物谱效结果差异的分析
目前采用血清谱效相关和药物谱效相关进行单味药及复方药效物质发现的研究已比较常见[21]，但两者的比较研究未见报道。笔者认为，立足于体内过程的谱效相关分析结果应与立足于复方本身的谱效相关分析结果进行比较，确定一致性并找出相互关系，不仅应明确影响药效的主要成分（即定性），也应明确成分含量高低对指标改善的影响（即定量），这样才可能有依据地控制药物中有效成分种类及量的大小，达到优化药物疗效的目的。具体到本研究，除对其相似性进行了比较外，还发现了以下差异：①在影响药效的主要成分中，吸收谱效中Lcs被选出，Re未被选出（表7），在药物谱效中则相反。在主要正向作用成分中，Rg1在吸收谱效中被选出，Rb1未被选出，药物谱效则相反。值得注意的是，表8结果显示汤中成分含量越高，越有利于Lcs，Rg1的吸收，而不利于Re，Rb1的吸收。不同的吸收特点是否是造成2种方法筛选结果差异的原因（如影响回归系数大小从而影响排序及筛选结果），有待进一步研究。②同样，对某些药效指标，同一种主要药效成分，在吸收谱效与药物谱效中回归系数正负相反，如Rb1对血清NO及NOS，Ev对5-HT，脑NOS的影响等。表8结果显示汤中这2种成分含量越高，则累积吸收量越低，与前人研究类似[5，22]，这可能是导致结果相反的原因。上述结果说明，分析外翻肠囊吸收谱效相关结果时，需要考虑药物成分浓度对自身吸收的影响，以指导吴茱萸汤各成分的调控，从而优化治疗作用。
4.5 关于PLSR
目前谱效相关研究多采用多元线性回归分析或多元相关分析进行[23-24]，这些分析方法在样本数小于等于自变量数或自变量间存在多重共线性时不适用。PLSR是谱效相关中分析方法的一种，有效解决了上述问题[25]，但尚未见用于复方药效物质发现研究的报道，本试验应用结果证明可行。
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Study on pharmacological ingredients of Wuzhuyu Tang treating
migraine by correlating absorption ingredients in everted intestinal
sac and pharmacodynamics
PAN Xue-qiang， WU Yan-chuan， GONG Mu-xin， XU Yong-song， WANG Zhi-min， ZHANG Qi-wei， SHANG Ya-wen， LU Xu-ran， SONG Ya-fang
（1.School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；
2.Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China；
3. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；
4.Capital Medical University Yangjing Medical College， Beijng 100300， China）
[Abstract] Wuzhuyu Tang is a classical formula for treating migraine， but its′ pharmacological ingredients is unclear yet. Present study employed the everted intestinal sac model to collect the absorption samples of 10 kinds of Wuzhuyu decoction， and then analyzed the contents of 9 ingredients in Wuzhuyu Tang and absorption samples quantitatively or semi-quantitatively by HPLC-DAD method. Reserpine was used to establish the mice model of migraine， and then the contents and activities of 5-hydroxytryptamine， noradrenaline， dopamine， nitric oxide and nitricoxide synthase in brain tissues and serums were determined respectively after oral administration of Wuzhuyu Tang. Using the partial least squares regression method to correlate the total absorption quantity of 9 ingredients and pharmacodynamics. The result shows that limocitrin-3-O-β-D-glucoside， ginsenoside Rg1 and Rb1， rutaevine， limonin， evodiamine and rutaecarpine are the main ingredients influenced the effects in absorption samples in everted intestinal sacs， especially ginsenoside Rg1， rutaevine， evodiamine and rutaecarpine among them have obvious improving effects to most pharmacodynamics index， might be the pharmacological ingredients influenced the therapeutical effects of Wuzhuyu Tang treating migraine.
[Key words] Wuzhuyu Tang； migraine； everted intestinal sac absorption fingerprint-effect relationship； partial least squares regression； pharmacological ingredients
doi：10.4268/cjcmm20140124