杧果畸形病病原菌的营养体亲和性研究

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摘要：【目的】为了解我国杧果畸形病病原菌Fusarium mangiferae的营养亲和性及营养亲和群类型，【方法】以采自四川攀枝花市和云南华坪县等不同地区和不同杧果品种的38个畸形病病原菌为材料，在含KClO3 培养基上诱导筛选。【结果】共获得抗氯酸盐、不能还原利用硝酸盐营养突变体（nit）455 株，通过MM、NM、HM 等3种不同氮源培养基划分出nit A、nit B、nit C、nit D 4种突变类型，其中nitA出现频率最高，占总体的78.02%；nit B 和 nit C其次，分别占 7.91%和13.63%；nitD 最少，仅占0.44%。采用nit 突变体互补型配对技术，将获得的突变菌株进行配对培养，测得不同的营养体亲合群（VCGs）数为5 个，其中VCG1内包含30个菌株，3个菌株分布在VCG2内，VCG3和VCG4内各含有2个菌株，菌株MG33单独形成VCG5。【结论】我国杧果畸形病病原菌存在丰富的营养亲和群类型，分析发现F. mangiferae 的营养亲和群种类和杧果品种、地理来源间无明显相关性。

关键词： 杧果畸形病； nit突变体； 抗氯酸盐突变体； 营养亲和群

中图分类号：S667.7 文献标志码：A 文章编号：1009-9980 01206-1092-05

杧果畸形病俗称簇生病、簇芽病，是一种危害杧果正常生长的世界性病害，植株感病后嫩芽、花序簇生，不能正常开花坐果，给生产造成严重的经济损失。畸形病在世界各杧果主产国普遍发生，国内该病主要分布在云南、四川海拔较高的杧果晚熟地区[1-4]。Summanwar1966年首次从畸形病株成功分离出串珠镰刀胶孢变种Fusarium moniliforme var. subglutinans，并且用柯赫氏法则证明此菌为致病菌，随着科学技术与生产的发展，研究人员陆续发现该病均是由镰刀菌（Fusarium spp.）引起的，大都属于Gibberella fujikuroi类群，且F. mangiferae （起初被鉴定为F. moniliforme和F. moniliforme var. subglutinans）的地理分布最广[5-7]。然而在畸形组织中还检测到其他能致病的镰刀菌种类，已报道的主要有F. sterilihyphosum、F. equiseti、F. pallidoroseum、F. proliferatum和F. oxysporum等[8-10]。Zheng等[11]采用硝酸盐营养突变体互补型配对技术测定了多国杧果畸形病原F. subglutinans的营养体亲和群类型，74个菌株分属于7个，3个VCGs仅在一个国家发现，营养亲和群变化最大的分别是埃及和美国。至今国内杧果畸形病主要致病菌F. mangiferae存在的营养体亲和群种类未见报导，我们对F. mangiferae硝酸盐突变体进行了筛选并对营养体亲和性进行了研究，旨在利用nit硝酸盐突变体技术，分析不同杧果品种分离的菌株、不同地理来源分离的菌株的抗氯酸盐突变体和nit突变体的诱发规律，并对菌株进行营养体亲和群（VCGs）的划分。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

从我国杧果畸形病发病区（四川攀枝花市和云南华坪县）采集簇生芽和簇生花序。采用常规组织分离法分离。将病组织表面消毒后，置于PDA平板上28 ℃恒温培养。对形态学上初步鉴定为F. mangiferae的分离物利用特异性分子检测技术进行种级鉴定，最终确定F. mangiferae分离物，具体方法参考文献[10]。获得镰刀菌38个，其编号及其来源列于表1。

1.2 供试培养基

含氯酸盐培养基（KPS）：去皮马铃薯200 g，蔗糖10 g，KClO3 30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

KPS培养基用于nit突变株诱导，MM、NM和HM培养基用于nit突变株的鉴别，MM培养基用于亲和性配对测定。

1.3 诱变nit突变株和突变型鉴别

诱变nit突变体：各供试菌株在PDA上培养4 d后，在菌落边缘利用灭菌的打孔器打下直径为5 mm的菌饼，移植于KPS培养基平板上，每个皿均匀接种3个点，接种7个皿，25 ℃黑暗培养，以诱导nit突变株形成。5 d后开始观察，在受抑制生长的菌落边缘出现呈快速生长的扇形区即为角变区，用接种针在角变区挑取少许菌丝移植到MM平板上。如生长出的菌落无气生菌丝，菌丝稀薄，即可认定为nit突变体，每个突变体重复3次。将各nit突变体转移到MM培斜面上保存，供营养体亲和性测定。

nit突变体类型鉴定：分别把突变体移植到MM，HM及NM 3种培养基上，25 ℃培养3～4 d，每处理重复3次。根据突变体在3种培养基上的生长情况，把筛选到的nit突变体分为nitA、nitB、nitC、nitD 4种类型[12-14]。

1.4 nit突变株亲和性测定

1.5 营养体亲和群的测定

从各菌株nit突变体间气生菌丝生长情况，选择强亲和力的nit A和nit B、nit C各2株，各菌株的所有nit A和nit B或nit C突变体之间在MM平板上进行菌株间nit突变体配对培养，于25 ℃黑暗下培养7～10 d后，检查菌落边缘接触处气生菌丝生长情况，如在nit A和nit B或nit C间稀疏菌丝交界处出现了野生型生长，形成1条浓密的亲和带，则该2个菌株属于同一个VCG；若不能形成回复野生型生长的亲和带，则不属于同一个VCG。

2 结果与分析

2.1 F. mangiferae分离物的获得

2.2 nit 突变体的筛选和鉴定

2.3 F. mangiferae营养体亲和性测定

2.4 F. mangiferae营养体亲和群测定

将各菌株的nit A突变株和测试菌株的nit B或nit C突变体配对测定结果显示，结果38个菌株分为5个不同的VCGs，同一亲和群的菌株均能在两稀疏生长的菌落交界处产生浓密生长的营养亲和带（图版-D）。其中VCG2内有3个菌株（分别为MG05、MG29和MG31），VCG3和VCG4内各含有2个菌株，分别为MG03、MG26和 MG17、MG21，菌株MG33单独形成VCG5，其余30个菌株均分布在VCG1中。

2.5 杧果品种及地理来源和F. mangiferae营养体亲和群的相关性

3 讨 论

真菌的营养体亲和性又称体细胞亲和性，是指真菌菌株间菌丝能融合并交换细胞质或核物质的特性，根据营养体亲和性划分的群体称为营养体亲和群。其原理是利用病原菌的营养缺陷型突变株，主要是硝酸盐利用缺陷型突变株的配对互补现象，判断菌株间的遗传相似性，进而将其归为不同的营养体亲和群。所谓营养缺陷型突变株是指菌株由于受到某种物质的影响，而形成的突变株，该突变体失去了合成自身生长所必需的某种营养物质的能力，只有从外界摄取相应的营养物质才能维持正常的生命活动。而菌株间的营养体亲和性是受多个基因位点所调控，只有当配对的菌株间在其中的一个或多个位点存在相同的等位基因时2者才能在菌落交界处发生亲和反应，一般是形成旺盛的气生菌丝带。营养体亲和性及其营养体亲和群的研究最早用于曲霉属（Aspergillus），到目前已广泛用于真菌学特别是植物病理学中其他病原真菌如镰刀菌属（Fusarium）、轮枝菌属（Verticillium）、长喙壳属（Ceratocystis）、核盘菌属（Sclerotinia）、平脐蠕孢（Bipolaris）、炭疽菌属（Colletotrichum）、丛赤壳属 （Cryphonectria）、隐子座菌属（Cryptostroma）、间座壳属（Diaporthe）、炭团菌属（Hypoxylon）、半帚孢属（Leptographium）、羊肚菌属（Morchella）、链孢霉属（Neurospora）、青霉属（Penicillium）、柄孢壳菌属（Podospora）、壳针孢属（Septoria）和木霉属（Trichoderma）等的遗传变异和位点分析、种群的地理分布、专化型或生理小种、毒力关系及其致病性的测定、寄主范围、菌株间产生抗菌素等生理活性物质的差异分析、病害的流行及生物防治等领域[12-17]。利用含氯酸钾培养基对来源于我国杧果畸形病发病区的F. mangiferae菌株进行诱变获得484个突变体中455个为nit突变体，突变频率为94%，说明杧果畸形病病菌发生抗氯酸盐突变体变异的频率较高。采用突变体互补型配对技术，测定出分离自‘凯特’、‘红象牙’等7个杧果品种38个菌株分属于5个VCGs，其中VCG2、VCG3和VCG4内分别含有3、2和2个菌株，菌株MG33单独形成VCG5，其余30个菌株均分布在VCG1中，试验中还发现菌株形成的VCGs与其寄主杧果品种、地理来源之间无明显相关性，表明我国杧果畸形病病原菌的田间群体结构较为复杂。试验中还发现在获得的突变体中，nit B型突变体占的比例较nit C少，且某些菌株只获得了nit C或nit B型突变体，出现这一现象的原因是培养基和培养条件影响所致，还是与菌株本身的遗传特性有关，尚有待进一步研究。本研究明确了F. mangiferae的营养体亲和性和VCGs 结构及其与菌株地理来源和杧果品种的关系，为进一步研究F. mangiferae群体的遗传多样性及其遗传结构提供了必要的试验依据，并对该菌所致病害的综合治理、抗源筛选及抗病育种研究具有参考价值。（本文图版见插2）

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