灭多威对家蝇胚胎细胞系细胞色素C及Caspase 3的影响

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摘要：为寻找家蝇防治新靶点提供新的思路，研究灭多威作用于家蝇胚胎细胞系MDEC-07114细胞后对细胞色素C和caspase 3的影响。用4 mg/mL灭多威干预MDEC-07114后，分别于加药后2、6、12、24 h收集细胞，用蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞色素C和Caspase 3的表达。结果表明，细胞色素C随作用时间的延长释放增多，Caspase 3随作用时间的延长活性增强。根据试验结果，推测灭多威可能是通过损伤线粒体膜，引起细胞色素C的释放，进而激活Caspase 3，发生蛋白酶级联反应，从而导致MDEC-07114细胞凋亡。

关键词：家蝇胚胎细胞系；MDEC-07114细胞；灭多威；细胞色素C；Caspase 3

中图分类号：Q965.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5482-03

昆虫细胞凋亡途径，尤其是类似哺乳动物细胞的线粒体途径中细胞色素C（CytC）的释放，在不同昆虫的研究中结论有所不同[1-5]。MDEC-07114是遵义医学院自建的家蝇胚胎细胞系，灭多威为常用氨基甲酸酯类杀虫剂。前期研究表明灭多威可以诱导MDEC-07114细胞凋亡，并且引起线粒体变化[6]。本试验拟研究灭多威作用于MDEC-07114细胞后对细胞色素C和Caspase 3的影响，探讨线粒体途径在MDEC-07114细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 供试细胞

家蝇胚胎细胞系MDEC-07114，由遵义医学院寄生虫学教研室提供。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 M3培养基，Sigma公司生产，S3652型；胎牛血清，杭州四季青生物工程研究所生产；99.9%灭多威，北京恒元启天化工技术研究院生产；PVDF膜，Millipore公司生产；蛋白预染Marker、RIPA裂解液，碧云天生物技术有限公司生产。

1.2.2 主要仪器 Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳槽，美国BIO-RAD公司生产；SP-9型电转仪，大连竞迈科技有限公司生产；Odyssey双色红外荧光成像系统，美国LI-COR公司生产。

1.3 方法

1.3.1 MDEC-07114细胞培养 取液氮冻存的MDEC-07114复苏传代，28 ℃ 5% CO2孵育箱中培养[7]，待生长稳定后进行试验。

1.3.2 试验分组 处理组为4 mg/mL灭多威组，对照组为等量的培养基。分别于加药后2、6、12、24 h收集细胞。

1.3.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测CytC、Capase 3 收集细胞，PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min，加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min获得总蛋白；用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。每孔上40 μg总蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V恒压，15 min；120 V恒压，90 min。电泳结束后，半干转印90 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入封闭液4 ℃封闭过夜；PBS清洗3次，每次5 min；加入一抗，室温孵育2 h；PBST清洗3次，每次5 min；加入二抗，室温孵育2 h；PBST洗涤3次，每次5 min。X光压片显影，Odyssey远红外成像系统扫膜，读取OD值。

1.4 数据处理

所有数据用平均值±标准差（x±s）表示，SPSS软件包辅助处理，单因素方差分析，t检验，P

2 结果与分析

2.1 CytC水平的变化

灭多威作用于MDEC-07114细胞后对CytC的影响见图1、图2。4 mg/mL灭多威作用于MDEC-07114细胞后，CytC水平随时间的延长逐渐增加，与对照组差异显著。说明随作用时间的延长，CytC释放增加。

2.2 Capase 3活性变化

灭多威作用于MDEC-07114细胞后对Caspase 3的影响见图3、图4。Western blot检测结果显示，4 mg/mL灭多威作用于MDEC-07114后，Caspase 3活性随作用时间延长逐渐增加，与对照组差异显著。

3 小结与讨论

对哺乳动物中线粒体信号途径介导的细胞凋亡机制研究认为，线粒体在凋亡过程中可能起着中心调控作用，可通过释放CytC导致凋亡发生[8]。正常情况下CytC位于线粒体内、外膜之间，凋亡刺激物可引起CytC从线粒体易位释放入胞浆，并与胞浆中的凋亡蛋白水解酶活化因子（Apaf-1）结合形成CytC/Apaf-1复合物，激活Caspase 9，活化的Caspase 9激活Caspase 3，从而启动了Caspase级联反应，导致凋亡发生[9]。而在有关果蝇细胞凋亡的研究报道中，不同细胞的凋亡过程CytC的作用有所不同。在果蝇的胚胎细胞和的凋亡过程中，CytC发挥着重要的作用[10，11]，而在果蝇S2和BG2细胞系的凋亡过程中，CytC并未从线粒体中释放，未参与凋亡体的形成[12，13]。关于家蝇细胞凋亡途径的研究鲜有报道。本研究用灭多威作用于MDEC-07114细胞，Western Blot检测显示细胞色素C随作用时间的延长释放增多，Caspase 3随作用时间的延长其活性增强。

前期研究发现，灭多威作用于MDEC-07114细胞后，可引起线粒体结构改变，线粒体膜电位降低。由此推测，灭多威诱导家蝇细胞凋亡可能是通过损伤线粒体膜，引起细胞色素C的释放，进而激活Caspase 3，启动Caspase细胞凋亡通路，进而导致细胞凋亡。

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