仙鹿健骨汤含药血清对成骨细胞矿化结节及BMP-2表达影响的实验研究

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摘要 目的:观察仙鹿健骨汤含药血清对体外培养的新生SD大鼠成骨细胞矿化功能及骨形成蛋白(BMP-2)表达的影响。方法:取12周龄Wister雌性大鼠48只,随机分为6组,每组8只,分为仙鹿健骨汤低、中、高剂量组(A、B、C组),α-D3对照组(D组)、模型组(E组)及空白对照组(F组),制备含药血清备用。成骨细胞建立采用新生SD乳鼠5只(24h内颅盖骨)进行体外细胞传代培养,分别采用茜素红染色、免疫组化染色法观察体外培养成骨细胞矿化结节变化及成骨细胞BMP-2表达。结果:B、C组及D组对成骨细胞矿化结节形成的作用均优于E组,并接近于F组水平,但组间比较无明显差异,通过免疫组化染色发现各组均有bmp-2的棕黄色深染,但B、C组阳性细胞比例明显高于其他各组,与E组比较有显著差异。结论:仙鹿健骨汤含药血清能明显增加成骨细胞矿化结节形成数,促进矿化功能,并且提高成骨细胞BMP-2表达水平,这可能是该方防治骨质疏松症的机理之一。

关键词 骨质疏松症 成骨细胞 碱性磷酸酶 实验研究 仙鹿健骨汤 大鼠

仙鹿健骨汤具有温补肾阳、健脾活血的功效,治疗骨质疏松有良效。本实验利用血清药理学和细胞培养相结合的方法,着重探讨仙鹿健骨汤含药血清对体外培养成骨细胞的矿化功能及对BMP-2表达的影响,从细胞学角度观察探讨此方治疗骨质疏松症的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物:12周龄的雌性Wistar大鼠48只,体重为200±20g,新生大鼠5只,由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验药品:仙鹿健骨汤组成:仙灵脾、鹿角胶、骨碎补、仙茅、黄芪、白术、仙鹤草、当归。由温州医学院附属第一医院中药房提供,水煎浓缩后分别含生药0.5g/ml、1g/ml、2g/ml。α-D3:以色列梯瓦制药工业有限公司生产,批号(95)卫药准字J-10号,水溶液浓度为0.005μg/ml。氯氨酮:上海第一生化药业有限公司生产,批号国药准字H31021897。

1.3 实验方法:①去势大鼠造模:取40只大鼠,腹腔注射戍巴比妥钠(3μg/100g)麻醉,去除双侧卵巢,逐层缝合,随机分成仙鹿健骨汤低、中、高剂量组(A、B、C组)、α-D3对照组(D组)、模型组(E组)5组,每组8只;另8只为空白组(F组)。②血清制备:各组每天均以10ml/kg,分别给予仙鹿健骨汤水提液(A、B、C组)、α-D3水溶液(D组)及生理盐水灌胃(E、F组),1天1次,连续10天。动物处死前1h再灌胃1次,动物给予氯氨酮麻醉,右心室抽血,采集到的血液,4℃静置4小时,3000r/min离心30min,收集血清,56℃水溶灭活补体。-20℃保存,保存时间不超过3周。使用前用培养基稀释,过滤膜除菌。③新生大鼠颅骨成骨细胞制备及培养:取新生大鼠(24小时内),无菌取颅骨,剔除粘附的结缔组织和血管,剪碎约1×1mm3,加含0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.1%的透明质酸酶的消化酶消化,消化5个循环,每次20min,其间不时摇动,取3、4、5次消化的细胞悬液,1000r/min离心10min弃上清,沉淀的细胞用10%胎牛血清(FCS)DMEM培养液重悬,吹打均匀后,接种到培养瓶中,培养瓶置于37℃,5%CO2孵箱孵育,24小时换液,待细胞80%～90%贴壁后,0.25%胰酶消化使贴壁细胞消化松解,轻摇培养瓶,细胞即脱壁,以终浓度1×105/ml接种于培养瓶内,进行传代培养,取第3代细胞。④碱性磷酸酶(ALP)鉴定成骨细胞:ALP是成骨细胞的特异性标志酶,因此可以用其染色来鉴定成骨细胞,我们采用钙钴法来显示ALP;将无菌玻片放入培养皿,待细胞长至半汇合后取出,PBS冲洗后用丙酮固定10分钟,蒸馏水冲洗数次,入孵育液,孵育4～6小时,蒸馏水冲洗,2%硝酸钴中浸染5min,蒸馏水冲洗数次。1%硫化铵作用1分钟,自来水洗,ALP阳性细胞胞浆应呈现黑色颗粒。孵育液为:3%β-甘油磷酸钠5ml、2%巴比妥钠5ml、2%硝酸钙10ml、2%硫酸镁5ml、蒸馏水25ml。其中2%硝酸钙、2%硝酸钴和1%硫化铵要临用前新鲜配置。⑤不同稀释比的血清对矿化结节的影响:成骨细胞接种密度为2.2×104个/cm2加入12孔塑料培养板,用10%新生牛血清(NCS)MEM培养液,其中含有50μg/ml维生素C与10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。2天换液1次,于14天用95%乙醇原位固定,0.1%茜素红染色30min,用有格(0.2mm×0.2mm)涤纶薄膜贴附于培养板底部,低倍光镜下作矿化结节计数。⑥不同稀释比的血清对BMP-2表达的影响:成骨细胞接种密度为1×105个/ml加入96孔板,每孔100μl,96孔板内预置10mm×10mm灭菌盖玻片。加药方法同前,细胞加药后培养72h,培养结束时去除培养液。细胞贴片经PBS漂洗后晾干,4℃丙酮固定10min;PBS漂洗1遍,3%H2O2孵育10min,消除内源性过氧化物酶的影响;PBS漂洗5min,3次。以PBS1:100稀释的Ⅰ抗(山羊抗小鼠的BMP-2抗体)4℃湿盒过夜,PBS漂洗5min,3次。羊抗小鼠的Ⅱ抗室温30min,PBS漂洗5min,3次。辣根酶标记的链霉卵白素工作液室温15min,PBS漂洗5min,3次。二氨基联苯胺显色,自来水充分冲洗,苏木精复染细胞核,透明,封片。电镜下观察成骨细胞胞浆中及胞膜上阳性染色颗粒的数量及颜色深度。结果判断:计算200个细胞(骨细胞、成骨细胞、软骨细胞),阳性细胞50%为(+++)。HE染色观察成骨细胞并计数。

1.4 统计学方法:采用SPSS10.0统计软件包进行统计。各组数据采用x±s表示,计量资料用单因素方差分析(one-way ANOVA),计数资料采用χ2检验。以P

2 结果

2.1 细胞矿化结节的测定:在矿化结节的数量上,与E组(11.63±2.71)比较,B组(18.72±3.35)、C组(18.34±2.72)、D组(20.19±2.45)和F组(21.22±2.73)差异均有统计学意义(P0.05),而A组(13.03±1.96)与E组比较无显著性差异(P>0.05)。

2.2 仙鹿健骨汤对BMP-2表达的影响:各组均有成骨细胞胞浆棕黄色深染的结果,但B组(阳性率100%)、C组(100%)与E组(37.5%)比较,差异均有统计学意义(χ2=4.655,P0.05),而A组(62.5%)、D组(75%)、F组(75%)与E组之间比较无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

通过体外成骨细胞培养及其药物干预研究是寻找有效防治骨质疏松症药物的重要手段之一,成骨细胞由具备多向分化潜能的间充质细胞分化而来,能分泌产生多种细胞外基质蛋白,负责骨基质的合成、分泌和矿化,在骨组织的生长、发育与重建过程中起重要作用。体外培养的成骨细胞表型发育与体内的发育有很多相似之处,都经历细胞增殖、细胞出现功能分化及其基质成熟和基质矿化3个阶段。ALP是一种较为肯定的成骨细胞分化的早期指标,它的表达和分泌会随着细胞分化的进展而增强,在成骨细胞分泌ALP后,还会分泌其他的骨基质并引起细胞的融合及基质的矿化。矿化结节形成是成骨细胞进一步分化成熟的表现,也是骨形成的特异性敏感标志。BMP-2是具有特殊生物学活性的细胞生长因子,是细胞外的骨基质成分,是目前已知的对骨形成作用很强的生长因子之一[1],BMP-2对多种细胞的促分化作用主要通过增加细胞ALP活性、骨钙素和胶原蛋白合成及分泌而发挥作用[2-3]。对骨质疏松症的研究表明[4],骨质疏松症患者疏松的骨质局部BMP-2基因表达明显下降,致使骨髓中许多可被BMP-2诱导成骨的基质干细胞的增殖分裂明显减少,骨小梁稀薄,认为体内BMP-2含量的减少是其重要病理过程之一。

仙鹿健骨汤(仙灵脾、鹿角胶、骨碎补、仙茅、黄芪、白术、仙鹤草、当归)是狄任农先生多年来临床用于治疗骨质疏松症的经验方。方中以仙灵脾、鹿角胶为君药温肾壮阳;骨碎补、仙茅补肝肾强筋骨,以助增强补肾之功;黄芪、白术益气健脾,以养后天;仙鹤草、当归养血活血。诸药合用,共收补肾健脾活血之功,使肾精得充,骨筋濡养有渠。而且仙鹿健骨汤的组成药物中有多味已被研究证实具有治疗骨质疏松症的作用[5-8]。从本研究结果比较来看,较之模型对照组,中高浓度组中药含药血清对成骨细胞矿化结节形成均有显著的促进作用,但其作用不随剂量增长而加强,而低浓度组含药血清与模型对照组比较则无明显差异;从试验发现各组均有BMP-2的棕黄色深染,但中、高剂量仙鹿健骨汤阳性细胞比例明显高于其他各组,与模型对照组比较有显著差异。显示仙鹿健骨汤含药血清能明显增加成骨细胞矿化结节形成数,促进矿化功能,并且提高成骨细胞BMP-2表达水平,从细胞因子水平上阐明了其治疗骨质疏松症的可能机理。

中医药治疗骨质疏松的特点是着重于整体调节,调动内因,作用于骨质疏松症发病的多个环节,最终达到抑制骨吸收和增加骨形成的功效。可以说其疗效机制是多组分、多环节、全方位、多靶点的调整作用。但目前的研究还存在一些问题,如动物模型不尽如人意,治疗方法过于单一,疗效还不够理想,疗效机制还不够明确等。所以,用先进的研究方法和手段来揭示中医药治疗骨质疏松症的机理,开发新的药物,将是今后中医、西医和中西医结合工作者共同的责任。

4 参考文献

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收稿日期 2009-09-02