大鼠急性脊髓损伤后Bak基因的表达及其意义

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[摘要] 目的 探讨Bak基因在大鼠急性脊髓损伤（ASCI）中的表达及其意义。 方法 选取64只SD大鼠随机分为模型及对照两组，每组32只，模型组以改良Allen's法制作SD大鼠急性脊髓损伤动物模型，对照组只行椎板切开不损伤脊髓。分别于伤后3 h、1、3、7 d时（每个时间点8只）应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；然后处死动物，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和Bak基因表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度及细胞凋亡指数来表示。 结果 对照组大鼠下肢功能均无明显瘫痪，模型组大鼠下肢均出现不同程度功能障碍，对照组各时间点的Tarlov评分均高于实验组（P

[关键词] 脊髓损伤；Bak基因；细胞凋亡；Bcl-2家族

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）12-26-04

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）包括原发性和继发性两种形态，以后者最为多见，多由急性外伤引发。随着现代机械产业和交通运输的发展，其发病率在世界范围内逐年升高，为目前全球性医学研究热点之一[1-2]。研究结果显示，脊髓损伤可累及感觉、运动、反射等多项生理功能；临床表现为组织水肿、缺血、细胞坏死等，其中，神经细胞凋亡为其继

发退变的主要机制。Bak基因为Bcl-2同源类似物，可介导Bcl-2的凋亡抑制效应，具有促凋亡样作用。临床癌症研究结果显示[3-4]，Bal-xl/Bak表达异常，可介导癌细胞的增生或凋亡过程，影响患者的病情进展和预后转归。近年研究表明，Bcl-2家族在脊髓损伤的发病过程中，发挥了重用作用，其中Bcl-2低表达为脊髓神经细胞大量凋亡的重用触发因素之一。本研究以急性脊髓损伤大鼠模型的Bak表达情况与神经细胞凋亡的关系为切入点，探讨Bak基因在大鼠急性脊髓损伤（ASCI）中的表达及其意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与分组 健康SPF级SD大鼠64只（由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供），雌雄各半；月龄3～3.5个月，平均（3.2±0.6）个月；体重205～240 g，平均（221.0±17.3）g。随机分为模型组和对照组各32只，适应性饲养3～5 d；饲养环境：温度21～25℃，湿度55%～65%。

1.1.2 主要仪器 Allen's撞击器（采用不锈钢自行制备）；全自动石蜡切片机（ERM4000，常州市郝思琳医用仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（WD841-1，吴江万达电热设备有限公司）；超低温冰箱（DW-86L205，广州傲雪制冷设备有限公司）；荧光显微镜（CYG-055D，麦克奥迪）等。

1.1.3 主要试剂 青霉素注射液（山东鲁抗医药股份有限公司）；庆大霉素注射液（山东鲁抗医药股份有限公司）；HE染色液试剂盒（上海亿欣生物有限公司）；TUNEL试剂盒（南京凯基）；Bax一抗（abcam）；Bax二抗（abcam）；其他试剂如二甲苯、蔗糖、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠脊髓损伤模型的制备方法 模型组以改良Allen's法制备脊髓损伤大鼠模型，对照组行椎板切开，不损伤脊髓。制备方法：（1）1%戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖板；（2）以浮肋与13胸椎连接处为基准点，在5 cm2范围内脱毛，显露光滑皮肤组织；（3）酒精消毒，以消毒器械操作，在后正中线2～3 cm做纵行切口，依次切开皮肤、筋膜，可见白色腱膜；（4）借助剥离分针钝性剥离椎旁肌肉丛，可暴露棘突、椎板和横突；（5）定位并标记T10胸椎，在椎体上下中横向切口，再以两个纵向切口将其连接成方形结构，并以咬骨钳去除该骨板，显露方形骨窗；（6）以自制Allen's撞击器打击T10胸椎内侧，保持自由落体运动，控制高度约2.5～3.0 cm，每次击打保持在打击点停留2～3 min；（7）至脊髓组织出现血肿，硬脊膜呈紫红色停止击打，缝合伤口；（8）单笼饲养，青霉素联合庆大霉素抗感染，并人工辅助排尿，保持垫料清洁，并及时清理伤口分泌物。

1.2.2 大鼠脊髓损伤模型的评价方法 本实验以组织学病理特征和神经功能评分作为模型评价标准。

1.2.2.1 神经细胞形态学观察方法 （1）1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，行4%多聚甲醛心脏灌流，灌流前以生理盐水冲净循环系统血液，至脏器白化后方可滴注多聚甲醛；（2）取T9～T11椎体之间所有脊髓组织，浸泡于4%多聚甲醛12～24 h，以常规蔗糖梯度脱水法脱水，石蜡包埋；（3）包埋后石蜡块可于-70℃超低温冰箱保存，使用时以恒冷箱切片机切成15μm切片，常规HE染色，观察组织形态。

1.2.2.2 神经功能评定方法 按照改良Tarlov标准，见表1；采用双盲法，由2位观察人员打分，每只大鼠观察5次，每次5 min，记录总分，取平均值。

1.2.3 Bak基因表达测定方法 采取常规免疫组化染色法测定石蜡切片Bak基因表达，一抗和二抗浓度分别为0.5%、1%，封片后荧光显微镜观察，并以麦克奥迪数码医学图像分析系统进行光密度测定。

1.2.4 神经细胞凋亡指数测定方法 按TUNEL试剂盒说明书操作：（1）石蜡切片常规脱蜡至水，先后经蛋白酶K、3% H2O2、甲醇处理，小牛血清封闭；（2）混匀TUNEL反应液，滴于玻片组织面，恒温箱孵育，37℃，1 h；（3）荧光显微镜检测，并以麦克奥迪数码医学图像分析系统进行细胞计数，在高倍光镜下，选取5个视野，计算神经细胞指数，取平均值。

1.3 统计学处理

所有数据均以统计学软件SPSS17.0进行分析；计量资料以（）表示，行t检验；计数资料以率或构成比表示，行x2检验，P

2 结果

2.1 模型制备结果

本组大鼠共制备模型32只，2例死亡，其他大鼠均全部存活，模型制备结果如下。

2.1.1 病理切片形态学变化 病理切片显微观察结果显示，模型组大鼠各时间点脊髓组织均有不同程度血肿和坏死；而对照组大鼠无明显变化。

2.1.2 神经功能评分比较 对照组大鼠下肢功能基本处于正常状态，而模型组表现出不同程度功能障碍，其Tarlov评分显著低于对照组（P

2.2 Bak基因表达结果

对照组未见明显Bak基因表达，模型组Bak基因表达于术后3 h点出现，1 d增加，3 d达高峰，7 d明显减少；其各时间点Bak基因表达均明显高于对照组（P

2.3 神经细胞凋亡指数

对照组未见明显神经细胞凋亡，模型组神经细胞凋亡于术后3 h点出现，1 d增加，3 d达高峰，7 d明显减少；其各时间点神经细胞凋亡指数表达均明显高于对照组（P

3 讨论

SCI可分为原发性和继发性两大类，前者是指脊髓组织受直接机械外力作用而发生的实质性损伤；后者则是指脊髓组织受损后的继发性病理改变，以神经元受损和神经细胞凋亡为主要微观特征，表现出组织水肿、微循环障碍、缺血性坏死、及继发性炎症等一系列病理征象。本组实验以改良Allen's法制备脊髓损伤大鼠模型，重在研究其脊髓受创后的继发性病理变化以及在这一变化中Bak基因与神经细胞凋亡的相关性；根据本实验研究结果，分述如下。

3.1 模型的制备

本实验以Allen's打击法制备大鼠脊髓损伤模型，采取自制不锈钢Allen's撞击器。长度大于创面，并以刻度标记，方便根据轴点计算不同击打高度的击打力度。本组实验选取击打高度2～3 cm，击打重量约为120～180 g。其基本理论依据为以一定力量撞击脊髓，造成突发性机械力损伤；伴随击打次数增多，出现血肿、组织坏死等病理表现，最大限度的模仿或接近人类骨髓损伤的病理反应态[5]。目前，相关脊髓损伤模型的研究，多以胸段脊髓为对象；根据国内外研究现状，结合临床实践，本实验选取T10胸椎体，主要基于以下考虑：（1）与临床病例收入情况保持一致。胸段脊髓损伤为临床患者最常见部位，因此，本实验首要定位为胸椎。（2）从大鼠解剖结构而言，T10部位解剖、定位操作比较简单，相应简化了手术难度，可保证定位的准确性及手术成功率。

模型评价结果显示，模型组大鼠各时间点脊髓组织均有不同程度血肿和坏死；而对照组大鼠无明显变化。对照组大鼠下肢功能基本处于正常状态，而模型组表现出不同程度功能障碍，其Tarlov评分显著低于对照组（P

3.2 Bak基因表达与细胞凋亡的关系

近年研究表明，SCI的最终损伤程度取决于细胞凋亡的最终状态；而细胞凋亡为脊髓损伤后的继发性进展，以局部神经生长因子缺乏、促凋亡因子激活等因素密切相关[6-7]。

Bcl-2和Bax分别为细胞凋亡抑制因子和促凋亡因子，研究表明[8]，Bcl-2在细胞凋亡调控中发挥重要作用，抑制多种因素或因子诱发的细胞凋亡，发挥凋亡抑制作用。Bcl-2主要存在于细胞线粒体，属于细胞凋亡的原癌基因之一，可在不影响细胞周期和分化的基础上抑制细胞凋亡、延长细胞寿命[9]。其作用机制尚未完全阐明，可能与以下因素有关[10]：（1）减少氧自由基产生和脂质过氧化物形成，起到抗氧化应激性损伤样作用；（2）抑制凋亡信号的细胞间传导，防止凋亡反应激活；（3）与其他促凋亡因子结合，抑制其活性。Bax的高表达对Bcl-2有抑制作用，从某种意义上讲，Bcl-2/Bax的活性状态最终决定了细胞的存活/凋亡状态。作为Bax诱导细胞凋亡的辅助分子，bak在近年的研究中日益受到重视。

目前研究已证实，促凋亡基因Bak可介导多种细胞的凋亡反应[11-12]。李红等[11]研究表明Bak干扰RNA可阻断人体颗粒细胞凋亡过程，从而起到延缓衰老的作用。陈广生等研究表明，Bak可参与人体大多数星形细胞瘤地凋亡过程，其作用力度在高分化的星形细胞瘤中显著高于低分化细胞。在癌症领域的研究中，亦有类似报道，包括乳腺癌、肝癌、肺癌等多种组织和多个系统[13-14]。在脊髓损伤的研究中，已证实Bcl-2系统的广泛性参与，而相关Bak的独立研究较为鲜见，其介导脊髓损伤的具体机制尚未完全明确[15]。本研究分析其可能与Bak对Bax的协调作用有关，而Bax是否可以发挥单独作用尚需深入研究。

综上所述，脊髓损伤的过程，呈以细胞凋亡为主的进行性进展态。在损伤后各时段，细胞凋亡指数与Bak呈现出一致的变化规律，即先增加后减少的典型特征。提示急性脊髓损伤激活Bak基因表达，从而诱导神经细胞凋亡，可能为其病情进展的重要机制之一。

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（收稿日期：2013-04-22）