培氟沙星人工抗原的合成与鉴定
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摘要：试验采用碳二亚胺（ＥＤＣ）法将培氟沙星（ＰＥＦＸ）与载体蛋白进行偶联，用于制备免疫抗原ＰＥＦＸ－ＢＳＡ与包被抗原ＰＥＦＸ－ＯＶＡ，通过紫外扫描和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对人工抗原进行鉴定，免疫原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，获得抗体。试验结果表明，间接ＥＬＩＳＡ方法检测小鼠血清抗体效价达到１∶６ ４００。为进一步制备抗ＰＥＦＸ单克隆抗体提供了良好的免疫原。
中图分类号：Ｓ８５９．８４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2278-02
Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｓ
ＦＡＮ Ｇｕｏ－ｙｉｎｇ，ＬＩＵ Ｊｕｎ－ｗｅｉ，ＺＨＯＮＧ Ｈｕａ，ＣＨＥＮ Ｊｕｎ－ｊｉｅ
（Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｕｐｌｅ ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ ｗｉｔｈ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＰＥＦＸ－ＢＳＡ ａｎｄ ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ＰＥＦＸ－ＯＶＡ． Ａｆｔｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｌｂ／ｃ ｍｉｃｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｈｅｄ
１∶６ ４００ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＰＥＦＸ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： pｅｆｌｏｘａｃｉｎ； aｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ； sｙｎｔｈｅｓｉｓ； iｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
培氟沙星（Ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ，ＰＥＦＸ），又名培氟哌酸，为第三代喹诺酮类抗菌药。具有广谱抗菌作用，不易产生耐药性［１］。但因培氟沙星易引起人的过敏反应，出现一些毒理作用，如心脏毒性、光毒性反应、软骨毒性及肌腱损伤、肝脏、肾脏毒性等而停止研发、试验及临床应用［２］。ＰＥＦＸ是小分子化合物，必须与大分子载体蛋白偶联才能作为免疫原。ＰＥＦＸ结构中含有羧基，可通过中间物ＮＨＳ在ＥＤＣ等有机溶剂的作用下与蛋白质的氨基结合形成偶联物，该试验利用偶联剂人工合成ＰＥＦＸ完全抗原，为进一步制备ＰＥＦＸ单克隆抗体提供优良的免疫原。
１材料与方法
１．１试验材料
１．１．１试剂乳酸培氟沙星标准品（９９．６％）购自中国兽医药品监察所；碳二亚胺（ＥＤＣ）、卵清蛋白（ＯＶＡ）、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Ｓｉｇｍａ公司，其他试剂均为国产分析纯。
１．１．２主要仪器ＨＩ９３２１酸度计（美国ＨＡＮＮＡ公司）；ＣＪＪ－７８１Ｃ型磁力搅拌器（上海浦江分析仪器厂）；Ｕ－３０００紫外扫描仪（日本岛津）；７２２型光栅分光光度计（日本岛津）。
１．１．３试验动物６周Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，河南科技学院残留物检测实验室饲养。
１．２方法
１．２．１完全抗原的制备采用碳二亚胺法［３，４］并加以改进。准确称取Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）２．８８ ｍｇ，碳二亚胺（ＥＤＣ）１０．２３ ｍｇ，培氟沙星（ＰＥＦＸ）３．２６ ｍｇ，加入２３０ μＬ的Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）。此溶液称为Ａ，并在室温下遮光搅拌孵育２４ ｈ。
准确称取牛血清白蛋白（ＢＳＡ）２６．４ ｍｇ，加入０．０１ ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ值７．４）磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）１．７２ ｍＬ，此溶液称为Ｂ。将孵育好的溶液Ａ逐滴加入到Ｂ，边加边搅拌，室温下搅拌３ ｈ。
反应结束，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ值７．４）ＰＢＳ透析，透析后溶液定容至３ ｍＬ，－２０℃分装保存。
同法合成包被抗原培氟沙星―卵清蛋白（ＰＥＦＸ－ＯＶＡ）。
１．２．２完全抗原的鉴定ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳鉴定，紫外扫描鉴定参见文献［５］。
１．２．３动物免疫用ＰＥＦＸ－ＢＳＡ免疫８周龄Ｂａｌｂ／ｃ小鼠８只，免疫方法参见文献［５］。
２结果与分析
２．１ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定结果
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定结果见图１。由图１可见，人工抗原ＰＥＦＸ－ＢＳＡ与ＢＳＡ进行比较，人工抗原泳道条带出现明显的拖尾，即可判断偶联成功［６］。
２．２紫外扫描鉴定结果
紫外扫描鉴定结果见图２。由图２可见，ＰＥＦＸ－ＢＳＡ特征吸收峰在２７５ ｎｍ处，不同于ＢＳＡ的２７８ ｎｍ，也不同于ＰＥＦＸ的２７１ ｎｍ。从理论上说，游离的药物全部透析出来后，该峰只能是由偶联到载体蛋白上的ＰＥＦＸ所提供，进一步说明偶联成功［７］。
２．３动物免疫试验结果
每只免疫鼠的多抗血清效价均达到了１∶６ ４００，达到了试验的预期目标，免疫抗原ＰＥＦＸ－ＢＳＡ免疫小鼠后产生了特异性的具有高度亲和力的抗体。
３讨论
培氟沙星属小分子化合物，必须与载体蛋白偶联才具有免疫原性。该试验采用碳二亚胺法进行偶联，反应条件温和，在较低的温度下也能在中性ｐＨ值中进行，但是此法没有选择性，易形成蛋白质间的聚合物而产生沉淀，所以采用两步法偶联：先将含羧基的培氟沙星分子ＥＤＣ反应，活化羧基，再加入蛋白反应物，以此来减少蛋白质间的交联［８］。能否产生相应抗体才是判定人工抗原合成是否成功的关键［９］。动物免疫试验结果表明，合成的免疫原可以刺激小鼠产生针对目的抗原具有高亲和力的特异性抗体，这充分说明利用该法合成的免疫原有效。该试验结果为下一步单克隆抗体的制备以及免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。
参考文献：
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［８］ 杨利国，胡少昶，魏平华，等． 酶免疫测定技术［Ｍ］． 南京：南京大学出版社，１９９８．２４２－２８６．
［９］ 李俊锁，邱月明，王超． 兽药残留分析［Ｍ］． 上海：上海科学出版社，２００２．２９４．
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