碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白的研究

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摘要：利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分别水解大豆蛋白，制备具大豆多肽，通过正交优化试验确定碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解的最佳水解条件，考察底物浓度、反应时间、反应温度、PH值与碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白的影响，为更好地利用大豆蛋白奠定基础。

关键词：碱性蛋白酶 木瓜蛋白酶 协同水解 大豆蛋白

中图分类号：R84 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0085-03

1 引言

1.1 研究意义与目的

本实验以大豆蛋白为酶解底物，选择工业用酶―碱性蛋白酶和常用的木瓜蛋白酶进行深度水解，引入正交试验设计方法，借助数学模型统计分析获得较高水解度的综合方案，探讨制备小分子大豆肽的最佳工艺，为开发功能性大豆蛋白，拓宽其应用领域奠定基础。

1.2 技术路线

实验技术路线如下：

豆粕（粉碎）加水调浆水浴（90℃ 10min）水浴搅拌调pH

蛋白酶水解灭酶（90℃ 10min）调酸（pH4.5）离心（4000转 10min）

2 材料与方法

2.1 实验材料

碱性蛋白酶2.4L：食品级，酶活力2.4AU/g，丹麦NOVO公司出品；木瓜蛋白酶：食品级，酶活力2000U/g，西安Wolsen公司出品；低温脱脂豆粕：含水量7.9%，蛋白质含量51.49%，脂肪含量0.86%，山东万德福。

2.2 主要仪器和设备

水浴锅：DK―98―1型，天津市泰斯特仪器有限公司；pH计：pHSJ―4A，上海精密科学仪器有限公司；精密增力电动搅拌器：JJ―1，常周国华电器有限公司；自动电位滴定仪：ZDJ-4A，上海精密科学仪器有限公司。

2.3 试验方法

2.3.1 水解条件的研究

（1）大豆蛋白的酶解反应。1）大豆蛋白预处理。豆粕粉碎后加水调浆制成各浓度大豆蛋白溶液，在90℃温度下恒温水浴10min。2）大豆蛋白的酶解操作。称取豆粕粉加入适量水配制成为一定浓度的大豆蛋白溶液，经恒温水浴预处理后，调节温度至反应温度搅拌20min，调节pH值至反应值，加入一定比例蛋白酶，在反应温度下进行恒温酶解，酶解过程中需要不断进行搅拌，同时通过滴加1N的NaOH溶液以保持反应体系pH值恒定，反应偏差一般控制在±0.1。记录NaOH溶液的滴加量，利用pH-stat法计算水解度。

（2）酶组合顺序的考察。在酶催化水解反应中，以pH值、温度、底物浓度、酶用量对反应速度影响较大，而酶用量是针对溶液中蛋白质的含量，与底物浓度成正比关系，因此只需确定适当的pH值、温度、底物浓度[1]。碱性蛋白酶最佳水解条件：pH8.5，60℃，[S]6%，酶用量6.0，木瓜蛋白酶最佳水解条件：pH6.7，55℃，[S]5%，酶用量0.51[2]。

因此结合碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳水解条件，建立表2实验来对酶组合进行考察。

2.3.2 最优水解条件下产物的制备与测定

（1）水解产物的制备。

将大豆蛋白酶解液加热升温至90℃，保温10min 使酶活力丧失。冷却至室温后取酶解液调节pH至大豆蛋白等电点（pH4.5）后取一部分酶解液在4°C静置6-24h，以备观察其沉淀情况。另一部分通过离心机在4000r/min，离心10min，制得上清液和沉淀。

（2）水解产物的测定。

1）沉淀的测定。把离心后的部分沉淀（m1）称量后放入烘干箱（65℃）内干燥3h后冷却至室温，取出称重后，再按以上方法进行复烘，每隔30min取出冷却称重一次，烘至前后两次重量差不超过0.005g为止，平行试验三个。把干燥物取出，称量离心管（m2）至恒重，记录数据。

2）上清液的测定。测定离心后酶解液的上清液体积（v），倒出上清液测量体积并置于4℃冷藏保存，用凯式定氮法测定蛋白质含量。

2.3.3 统计研究方法―正交试验设计法

在碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解大豆蛋白时，其水解度会随着pH值、水解温度（T）、底物浓度（[S]）等因素的变化会有所不同[2]。确定三因素的取值水平范围，以水解度（DH）为指标，选用三因素三水平实行正交试验设计方案进行研究。

3 结果与讨论

3.1 碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解条件的考察

3.1.1 水解顺序的分析

根据表2做的实验结果如表3。

结合表2和试验结果表3可知，实验组三、四、五的DH要大于实验组一、二的DH，说明了双酶水解的水解程度要大于单酶水解的水解程度。DH7>DH5>DH6、DH10>DH8>DH9、DH13>DH11>DH12，说明在同温同pH同底物浓度下，双酶同时水解的水解程度要大于双酶前后水解的水解程度。DH13>DH10>DH7>DH3>DH4，说明在同温同底物浓度下，不同pH的双酶同时水解的最小水解程度仍然大于双酶单独水解最佳pH情况下进行的前后水解的程度。可以得出结论，双酶同时作用水解要比双酶前后作用水解程度大。

3.1.2 正交试验确定最佳水解条件

结合酶组合的考虑和各因素间的相互依赖、相互制约，进行正交试验以确定各参数的最佳组合即酶解大豆蛋白的最佳水解条件。这里用正交表，以水解度（DH%）为测定指标，双酶同时水解，拟定出试验方案表来考察三个因素对水解的影响，水解时间为5h。因素分析表如表4。

正交试验表如表5。

由正交试验结果表5看出，空列R的值小于其它各因素的的R，可以判定个实验因素的效应R是可靠的。极值R越大，则表示因素的水平变化对实验的影响越大，在实验中越重要。在影响碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白的水解度的三个因素中，其影响程度大小为A>C>B，最优组合为A3B2C1。在此组合条件下水解5h，测得水解度为36.30%。故确定碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白的最佳水解条件：pH值为8.5，底物质量浓度为5.0%，水解温度为55℃。

3.1.3 最佳水解条件下的水解曲线

由图1可知，在双酶协同水解的最佳水解条件，水解1h，为保持恒定的pH（8.5）而消耗的碱量最大，此后消耗的碱量逐渐减少。在水解6h的延长时间里，蛋白质酶解液水解程度随着时间的延长明显增加，而在水解的6h后水解速度几乎不变。在水解时间达到6.5h时，水解度达到了36.44%。随着时间的延长水解度虽呈上升趋势，但蛋白酶可水解的肽键逐渐减少，从经济方面和水解液苦味的考虑，确定最佳水解时间为5h。

3.2 最佳水解条件下水解产物的分析

沉淀结果分析：100ml大豆蛋白溶液可制得约10g豆渣。上清液结果分析：100ml原料蛋白溶液可制的可溶性蛋白质约为214.2mg。另在4℃静置6-24h的酶解液，其沉淀情况很好，可以明显的看出上清液和沉淀。

4 结语

（1）将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的结合水解大豆蛋白，水解程度明显高于单酶水解，双酶加入顺序为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶同时水解较优。（2）双酶水解大豆蛋白的最佳工艺条件为：pH8.5、温度55℃、底物浓度为5%、碱性蛋白酶加酶量为0.051%（W/V）、木瓜蛋白酶加酶量为6%（W/V），在反应时间为5h的条件下，酶解液中可溶性大豆蛋白含量为3.06mg/ml，水解度为36.30%。（3）各因素对水解度的影响由大到小依次为：pH对水解度的影响最大，其它因素的影响从大到小依次为底物浓度>温度>时间。

参考文献

[1]朱秀清，许慧.酶法大豆蛋白水解程度控制研究.粮油食品科技第13卷，2005年第1期.

[2]李大明，宋焕禄.大豆蛋白酶解的研究[J]食品科技，2006，2.