荧光定量PCR技术在土传病害生物防治中的应用研究
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摘要:荧光定量pcr技术是进行生防菌和病原菌动态变化监测的有效手段,文章从定量PCR技术原理及其在植物病害生物防治中的应用两个方面进行了阐述。
关键词:荧光定量PCR;病原菌检测;生防菌监测
中图分类号:S476 文献标识码:A
文章编号:1674-0432(2010)-05-0025-1
深入研究自然土壤生态系中病原微生物和生防微生物的互作及种群生态学,对发展植病生防理论和进一步提高生防菌的防效具有重要意义。传统的方法包括平板计数法等耗时较长,存在较大误差,阻碍了本学科的深入系统研究。20世纪90年展起来的实时荧光定量PCR技术可以快速准确的的对微生物生物量进行定位,对土壤微生物生态学的研究提供了有力的科研手段和方法。
一、实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR方法包括探针类和染料类两种,前者对定量操作更加精细和准确。
经过多年的发展,实时定量PCR在土传病害生防的研究中得到了广泛的应用,国内外学者均有报道,技术日趋成熟,成为目前土壤中微生物定量研究的主要手段和技术之一,目前主要应用在两个方面,包括病原菌的检测和土壤中生防菌的动态监测,现阐述如下:
(一)土壤中病原菌的定量检测
在土传病害研究中,对致病菌的定量检测是判断病害发生流行的依据,通过Real-Time PCR技术对病原菌进行定量检测可以在最短的时间内掌握病原菌的动态变化规律,为掌握其发生发展规律,了解病害流行学,进行有效的防治提供必要条件。
Lees土壤主要病原菌立枯丝核菌AG-3融合群的定量PCR检测体系,根据保守区ITS序列设计定量PCR引物和TaqMan探针,对土壤中的立枯丝核菌AG-3进行了定量检测和动态跟踪,并在人工接种和自然土壤中均取得了不错的效果,为进一步研究其病害流行学以及病害发生动态提供了里理论依据。对马铃薯癌肿病致病菌Synchytrium endobioticum进行了定量PCR检测。刑楠利用实时荧光PCR技术检测土壤中水稻纹枯病原菌的群体动态变化;Schweigkofler利用Real-Time PCR技术结合改良的孢子捕捉方法对松树溃疡病致病菌Fusarum circinatum在空气中的孢子释放动态变化规律进行了定量研究,根据ITS序列设计特异性的定量PCR引物和TaqMan探针,通过改良的孢子捕捉方法收集孢子,提取基因组DNA,进行荧光定量PCR的定量检测,进行孢子释放量的动态跟踪,从新的渠道研究了松树溃疡病的发生发展规律,为病害流行学的研究提供了新途径。
(二)土壤中生防菌的动态变化监测
土壤微生物群落是一个动态变化和稳定的生态系统,各种微生物存在一定的制衡关系,一旦平衡被打破,就会造成病害的发生,而生防菌株对于土壤环境来说属于外来物种,其定殖扩展能力受到土壤内部微生物群落和土壤中的物理化学条件的影响,施用生防菌剂后,其防治效果和对病原菌的持续控制能力必须通过其在土壤中生物量的动态变化规律进行监测,传统的平板分离检测受到多种条件的制约,误差较大,通过荧光定量PCR检测技术,可以直观的评价生防菌的定殖情况。
Hagn建立了自然环境中生防木霉的荧光定量PCR体系,通过对木霉ITS区序列进行比对,设计出了木霉特异性引物,利用所设计引物还可以高效稳定地扩增含有木霉的土壤样品的环境总DNA。该实验体系的建立,为生防菌定量检测提供了思路,进一步推广了荧光定量PCR在生物防治中的应用,但是自然界土壤中木霉大量存在,为评价生防木霉菌株的定殖能力,必须设计其特异性的引物和探针进行检测和定量,Savazzini利用荧光定量PCR技术检测和定量研究了菌株Trichoderma atroviride SC1使用后在土壤中的动态变化规律,Savazzini对前人研究的几种木霉定量PCR说采用的引物进行了综合评估,结果表明ITS区虽然可以定量判断,但是特异性不明显,无法准确的检测同种的木霉菌株,后其根据木霉的几丁质酶基因设计引物和探针,并通过木霉特有的热激蛋白基因设计引物,以保证PCR产物的模板来自木霉,通过进行检测,与传统的平板检测方法进行了比较,结果差异不明显,其也为荧光定量PCR技术提供了新的方向,引物设计区不一定非要局限在ITS区域,根据物种自身的看家基因设计特异性引物,是今后相关领域研究的热点和新方向。
应用小型荧光定量基因扩增系统可实现对植物病害的现场快速诊断,对于疫情发生初期的传染源控制非常重要;另外,荧光定量基因扩增技术在病原研究、病害控制、生防制剂研究等方面应用同样具有一定的意义。可以说荧光定量技术为植物病理学、病害流行学、生物防治带来了全新的研究空间,节省了大量的时间,提供了更加精确的数据,减少了成本。
参考文献
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[2]形楠.土壤中水稻纹枯病菌的荧光定量PCR检测方法[D].北京林业大学,2005.
[3]Hagn Alexandra,Wallisch Stefanie,Radl Viviane,et al.A new cultivation independent approach to detect and monitor common Trichoderma species in soils.Journal of Microbiological Methods, 2007,69:86-92.
作者简介:孙显科(1972-)男,就职于辽宁凤城市赛马林场,助理工程师,研究方向:林业经营、保护。