七叶皂苷钠对大鼠脑出血后神经元Bax 、Bcl―2表达的影响

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【摘 要】目的：研究大鼠脑出血后脑神经元Bax（x蛋白基因）、Bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）的表达及七叶皂苷钠的干预作用。方法：采用Ⅶ型胶原酶脑内立体定位注射诱导大鼠脑卒中模型，60 只SD 大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、七叶皂苷钠组。选择术后1 d、3 d、7d 3个时间点处死大鼠后取脑，每点5 只。采用免疫组织化学SABC 技术，检测出血灶周围脑组织Bax 、Bcl-2蛋白的表达。结果：①模型组血肿周围Bax 、Bcl-2蛋白免疫反应阳性细胞1d 出现，3d 达最大值，7d 仍有表达（P

【关键词】脑出血；大鼠模型；细胞凋亡；七叶皂苷钠

【中图分类号】R527 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0017-03

脑出血是一个严重危害人类健康的公共卫生问题，占所有住院脑卒中患者的10%～30%，可导致严重的残疾和高病死率，6个月的病死率达30%～50%[1]。细胞凋亡作为一种基因调控的细胞死亡方式参与了缺血性脑组织损伤过程[2]。Bcl-2基因家族在调节细胞凋亡中发挥重要作用。Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2基因家族中重要的凋亡促进基因，其基因 产物Bcl-2、Bax是重要的凋亡调控蛋白。七叶皂苷钠具有提高静脉张力，改善微循环，恢复毛细血管通透性的作用[3-5]，它的溶栓，抗凝，降血粘度等功能不仅对已发生的血栓起治疗作用[6]，同时也能抑止进展型急性脑梗塞血栓的进一步发生，发展，从而避免病情进行性加重。检测大鼠脑出血后脑神经元bax、bcl-2的表达情况对于研究脑出血后组织损伤机制具有重要意义，探讨七叶皂苷钠对神经元Bcl-2、Bax表达的影响，有助于研究脑出血后保护神经细胞的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，清洁级，体质量250～300g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：20-001。

1.1.2 药物与试剂 七叶皂苷钠注射液（ 麦通纳） ，山东绿叶制药有限公司生产， 生产批号（ 2000510444） ；胶原酶（Ⅶ型，Sigma公司产品）；一抗，SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德生物公司；其余试剂均为国产分析纯级。

1.1.3 仪器 962-A型鼠脑定位仪，美国产。LAICA光学显微镜，德国产。Motic显微图像分析仪，Motic（中国）生产。飞鸽牌微量进样器，上海医用激光仪器厂生产。温度监测仪：XMD52208RS485万能通道巡检仪和Pt100电热阻，南昌百特公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药方法 60只SD大鼠随机分为4组，每组15只： （A）正常组；（B）假手术组；（C）脑出血模型组；（D）七叶皂苷钠组。每组再随机分到术后1d、3d、7d 3个时间点内。给药方法：A组生理盐水2mL/d腹腔注射；B组术后生理盐水2mL/d腹腔注射；C组术后生理盐水2mL/d腹腔注射；D组术后注射七叶皂苷钠10 mg/（ kg・d） ， 溶解于2 mL 生理盐水中腹腔注射， 第1 天于手术4 h 后开始治疗；各组于术后1d、3d、7d分三批各处死5只动物，收集包含血肿的脑组织标本进行各指标的检测。

1.2.2 动物造模 参照Rosenberg方法[7]。步骤：①大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（400mg/kg）麻醉后；②取俯卧位固定于鼠脑立体定位仪上；③局部消毒，切开皮肤，暴露颅骨，钻孔，在前囟后1.4mm，矢状缝向右3.2mm处垂直进针5.6mm，定位于苍白球，④以微量进样器缓慢注入0.4u Ⅶ型胶原酶的灭菌生理盐水2?l，留针5min，缓慢拔出针头，缝合皮肤。假手术组前③步骤方法相同，第④步骤注入灭菌生理盐水2?l。

1.2.3 脑组织标本采集 各组动物分别在相应的时间点用10%水合氯醛（400mg/kg）深麻醉大鼠后，迅速断头取标本置于4%的多聚甲醛中固定24h，脱水后石蜡包埋，用石蜡切片机以冠状切面连续切片，每片厚约5um，贴于明胶化玻片上，以作免疫组化用。

1.2.4 免疫组织化学 切片脱蜡至水，滴加3%H2O2液（室温10min），蒸馏水洗3次，微波修复抗原，滴加山羊血清封闭液，室温20min甩去多余液体不洗。滴加1：100稀释的一抗，4℃过夜，PBS洗3次，滴加生物素化二抗37℃孵育20min，再次PBS洗3次。滴加SABC，37℃30min，PBS洗4次，DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，切片再经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。每张切片400倍下显微镜观察，在血肿周围各取4个不重复视野，用显微图像分析仪测定Bax、Bcl-2阳性的神经元。

1.3 统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差“ x±s ”表示，多组间均数比较采用方差分析，（P

2 结果

2.1 大鼠脑出血后神经元细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达情况

正常组未见阳性细胞表达，假手术组除针道外其余部位未见阳性细胞，模型组脑神经细胞可看到Bax、Bcl-2蛋白阳性表达，于术后1d开始出现，之后逐渐增加，3d达最大值，7d仍有表达（P

2.2 七叶皂苷钠对大鼠脑出血后神经元细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的作用

七叶皂苷钠组于同时间模型组比较，在3、7d时有Bax蛋白表达降低，Bcl-2升高（P

3 讨论

近年来流行病学调查发现，脑出血是致人类死亡的第2大病因，病残率极高，且发病年龄日趋年轻，对社会和家庭造成巨大的负担，相当部分的患者虽早期行血肿清除，但预后仍然不佳，表明脑出血后继发的病理生理改变，对脑细胞造成的损伤是脑出血损伤的重要原因之一。一些动物实验和临床研究已证实，脑出血后相当一段时间内，在血肿周围甚至远隔区域会出现局部脑血流下降，这一缺血性损害与缺血性卒中有着相似的病理生理过程，血肿周围的缺血区域称为缺血半暗带（ischamic Penumbra，IP）[8]，IP区域的神经细胞有凋亡和坏死两种死亡方式，但以细胞凋亡为主[9]。因此，脑出血后继发损伤致神经细胞凋亡成为脑出血治疗中的研究热点。

细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmeddeach，PCD）。Bcl-2基因家族包含抑制和促进细胞凋亡两类功能相反的蛋白质，在细胞凋亡中发挥重要的调节作用[10]， Bcl-2蛋白是一种膜合蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜等处，能与Bax蛋白形成异源二聚体抑制细胞凋亡、延长细胞寿命；Bax蛋白是Bcl-2的同源蛋白，可通过自身形成的Bax同源二聚体促进细胞凋亡作用，并抑制Bcl-2的效应[11]。正常情况下Bax、Bcl-2在细胞中的表达处于一个动态平衡中，并受到机体的严格调控[12]。本实验结果显示，在脑出血模型组与假手术组比较Bcl-2和Bax表达均有增高，但Bax表达的增加较Bcl-2表达的增加更为明显，从而抑制Bcl-2的作用产生促凋亡作用。因此与Bcl-2蛋白表达阳性率与细胞凋亡率成负相关、Bax蛋白表达阳性率与细胞凋亡率成正相关结论相吻合。

七叶皂苷钠是由红参、麦冬组方制备而成中药复方注射液，其有效成分为人参皂甙，麦冬皂甙，麦冬黄酮等，加速ATP的合成，提高Na+K+-ATP酶活性，提高膜转运电位，防止Na+K+内流，降低毛细血管通透性，减少Ca2+的释放[13]，从而减轻缺血、缺氧所致的脑水肿。七叶皂苷钠的溶栓，抗凝，降血粘度等功能不仅对已发生的血栓起治疗作用，且同时也能抑止进展型急性脑梗塞血栓的进一步发生，发展，从而避免病情进行性加重[14]。目前关于七叶皂苷钠影响Bax、Bcl-2表达的文献鲜见，本研究结果表明七叶皂苷钠可降低Bax的表达，提高Bcl-2的表达，提示其有助于抑制组织凋亡，保护神经细胞。陈炜炜[15]的临床研究表明七叶皂苷钠可增强西药对脑出血的疗效。

综上所述，七叶皂苷钠可通过降低脑出血后血肿周围Bax的表达，提高Bcl-2的表达来抑制细胞凋亡，保护神经细胞，这为临床治疗急性脑出血提供一条新的途径，但其确切机制尚有待于进一步研究。

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基金项目：

湖南省教育厅（湘教2003-068-50）；湖南省重点学科（中西结合基础）资助。

作者简介：

雷久士，1957.6出生，男，湖南长沙人，副教授，主要从事老年病病理学研究。