MTT法检测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的研究

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[摘要] 目的:探讨3-(4,5)-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(mtt)药敏试验在指导临床乳腺癌化疗中的作用。方法:应用MTT法检测50例乳腺癌新鲜标本肿瘤细胞对10种化疗药物的敏感度。结果:对乳腺癌细胞抑制率强的药物为PTX、NVB、VP-16、5-FU、DDP,对乳腺癌细胞抑制率较弱的化疗药物为VCR、ADM、MTX、MMC、HCPT。结论:MTT体外药敏试验对指导临床乳腺癌个体化治疗具有重要意义。

[关键词] MTT法;药物敏感试验;乳腺癌

[中图分类号] R737.9 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)01(c)-028-02

Study on chemosensitivity of breast cancer with MTT assay

JIANG Ze1, XU Hua2, LI Shengshui2, ZHANG Fengmei2, LI Shuangbiao2, LIU Yan2

(1.Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 061001, China; 2.Cangzhou Combination of Chinese Traditional and Western Medicine Hospital, Cangzhou 061001, China)

[Abstract] Objective: To explore the value of MTT assay in vitro for patients with breast cancer. Methods: Chemosensitivities of ten chemotherapy drugs to cells of the breast cancer were detected by MTT assay. Results: The breast cancer cells were hypersensitive to anticancer drug of PTX, NVB, VP-16, 5-FU, DDP; hyposensitive to VCR, ADM, MTX, MMC, HCPT. Conclusion: MTT assay can help to select chemotherapy drugs and compose reasonable individual chemotherapeutic scheme.

[Key words] MTT assay; Drug sensitivity test; Breast cancer

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,术后通常辅以放、化疗。由于肿瘤细胞的异质性,往往不同乳腺癌患者的癌细胞对同种药物的敏感性是不同的。本实验采用3-(4,5)-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法体外进行乳腺癌细胞原代培养,检测10种化疗药物对不同个体乳腺癌细胞的细胞毒效应,旨在探讨该方法在筛选乳腺癌较敏感的药物和指导临床乳腺癌个体化治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源2004年11月~2006年12月乳腺癌根治标本50例,其中,来自沧州中西医结合医院22例,沧州市中心医院12例,沧州市人民医院5例,沧州市和平医院3例,泊头市医院3例,青县医院2例,黄骅市医院2例,东光县中医院1例。患者全部为女性,年龄29~75岁,平均43岁。所有病例均为首次治疗,术前未行放、化疗,且经术前穿刺活检或术后病理证实。

1.1.2 仪器MCD-15AC型CO2培养箱(日本Sanyo公司产品),DNM-9600型酶标分析仪(北京普朗公司产品),XDS-1B型倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品),BFX5-320型医用低速离心机(浙江省白洋离心机厂产品),生物安全Ⅱ级实验室及Ⅱ级生物安全柜(河北省长风净化设备厂产品)。

1.1.3 主要试剂RPMI 1640培养液,小牛血清,含10种化疗药物的微孔检测板,MTT试剂,二甲基亚砜(DMSO),“肿瘤化疗药物敏感度检测”MTT法试剂为泰伦生物科技(石家庄)有限公司产品(批号041025)。

1.1.4 抗癌药物阿霉素(ADM),长春瑞滨(NVB),顺铂(DDP),喜树碱(HCPT),紫杉醇(PTX),5-氟尿嘧啶(5-FU),长春新碱(VCR),足叶乙苷(VP-16),甲氨蝶呤(MTX),丝裂霉素(MMC)。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤单细胞悬液的制备无菌条件下切取直径约1 cm大小的新鲜肿瘤组织,尽量去除脂肪及坏死组织,置RPMI 1640培养液中1 h内送检,并于2 h内开始实验。在生物安全Ⅱ级实验室的Ⅱ级生物安全柜内,用PBS液反复洗涤后去除肿瘤边缘的纤维及脂肪组织,用眼科剪反复剪切成糊状,用200目不锈钢筛网过滤,并配制成2×105个/ml的细胞悬液。

1.2.2 肿瘤细胞培养将预制检测板从冰箱内取出,平衡至室温。将肿瘤细胞悬液均匀加入检测板微孔中(每孔200 μl),每种药物设2个复孔,另设空白对照与调零孔,将检测板置于37℃、5% CO2培养箱内培养48 h后,每孔加入MTT试剂20 μl,轻轻混匀,继续培养6~12 h,取出检测板以1 000 r/min离心15 min,每孔加入DMSO 100 μl,充分振荡直至微孔内的紫色结晶全部溶解,用酶标分析仪在570 nm处读取各孔吸光度(A)值。

1.2.3 抑制率计算及判断标准按以下公式计算相对抑制率(IR):相对抑制率(IR)=[1-(给药孔平均A值/对照孔平均A值)]×100%。根据计算出的IR值按以下标准判断每种药物的敏感度:IR>50%为高度敏感;30%≤IR≤50%为敏感;IR

2 结果

PTX、NVB、VP-16、5-FU、DDP对乳腺癌细胞的抑制作用较强,敏感率为74.0%~90.0%;VCR、ADM、MTX、MMC、HCPT对乳腺癌细胞的抑制作用较弱,敏感率为58.0%~72.0%。见表1。

表1 10种化疗药物对50例乳腺癌肿瘤细胞药敏检测结果(例)

3 讨论

MTT比色法的基本原理是:包括肿瘤细胞在内的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶,可将MTT还原成蓝色的甲(formazan),其生成量与药物作用后的细胞数目和(或)细胞活性呈正相关。20世纪80年代以后,有学将其用作评估药物对肿瘤细胞杀伤效果的药敏试验[1-3],后经逐步改良,应用于肿瘤细胞药物敏感试验[4]。该法快捷、简便、重复性好且无须放射性标记,对肿瘤临床化疗方案的制订具有一定的指导意义。

化疗是乳腺癌患者重要的治疗手段之一,然而不同个体乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性存在差异。因此,乳腺癌联合化疗的个体化用药日益受到关注。李胜水等[5]采用MTT法检测了25例乳腺癌患者外周血淋巴细胞以及8例乳腺癌患者的组织癌细胞对化疗药物的敏感性,发现BCNU、PTX、ADM、MIT 4种药物对两种细胞的抑制作用较强。本实验应用MTT法对50例乳腺癌患者进行药物敏感试验,结果显示各种抗癌药物对受试乳腺癌细胞的敏感性顺序为:PTX,NVB,VP-16, 5-FU,DDP,VCR,ADM,MTX,MMC,HCPT。结果显示,抑制率在30%~50%的中度敏感病例所占比例较大,测试药物对乳腺癌的敏感率以PTX最高,但其与NVB、VP-16、5-FU、DDP无显著性差异,而比VCR、ADM、MTX、MMC、HCPT等5种药物敏感率高(P0.05)。此外,部分病例同时对多种药物敏感,而有3例对10种药物全部耐药。黄小明等[6]比较了药敏阳性与阴性组的化疗效果,结果显示体外药物敏感性与临床化疗疗效符合率为73.3%。徐建明等[7]研究发现,对MTT敏感组的患者根据药敏结果指导临床化疗,其疗效明显优于凭经验给药的对照组及MTT耐药组患者。MTT敏感组73例患者,根据药敏结果,分别使用21种化疗方案,与经验对照组相比,方案的组成更灵活,治疗更有针对性,疗效也明显提高,其中还不乏出现病理完全缓解(CR)的典型病例,同时认为,该检测方法的假耐药可能性极小,临床可参照耐药结果,不再使用无效的化疗药物。此外,赵小华等[8]对MTT法药敏结果与临床疗效进行了对比分析,发现MTT法体外药敏试验与乳腺癌总的预测准确率为81.1%。由此说明,应用MTT法检测乳腺癌具有良好的敏感性,能反映药物对癌细胞群的杀伤作用,与临床相关性较好。

值得提出的是,该方法作为体外实验,分离培养的原代乳腺癌细胞由于脱离了正常人体环境,不能完全等同于体内恶性肿瘤细胞,加之受试癌细胞在分离过程中的机械损伤、分离纯化不充分而混有部分血细胞及成纤维细胞等均可造成假阳性或假阴性结果,使得某些病例测试结果出现偏差。笔者采用汪波等[9]的方法,用网眼较大的筛网(200目)对肿瘤组织进行过滤,制得的悬液主要由数个细胞形成的细胞团组成,这样可满足肿瘤细胞对其他细胞的依耐性,减少对肿瘤细胞自泌活动的影响,使肿瘤细胞的生长环境更接近体内,从而提高MTT体外药敏试验的准确性。另外,细胞数量、孵育时间、试验药物浓度、pH值等均可能影响试验结果。因此,不同的医疗科研单位仍需不断改进实验方法和摸索适宜的实验条件,从而完善MTT法在肿瘤化疗药物敏感试验中的应用,以期得到更可靠的结果。

[参考文献]

[1]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays [J]. J Immunol Meth, 1983, 65(1-2):55-63.

[2]Kusumoto T, Sakaguchi Y, Machara Y, et al. Comparison of in vitro anti-cancer chemo sensitivity between human squamous cell carcinoma and adenocarcinoma [J]. Oncology,1992,49:343.

[3]Singh B, Li R, Xu L, et al. Prediction of survival in patients with head and neck cancer using the histoculture drug response assay [J]. Head Neck,2002,24(5):437-442.

[4]李胜水,李双标,张风梅,等.MTT法检测胃癌患者肿瘤细胞对化疗药物敏感度的研究[J].现代检验医学杂志,2008,6(23):43-44.

[5]李胜水,于翠珍,崔克勤,等.预制检测板MTT法检测癌患者外周血淋巴细胞化疗药物敏感性的研究[J].实用医技杂志,2007,14(9):1182-1184.

[6]黄小明,蒋芹,李小民,等.MTT法指导乳癌化疗的临床研究[J].临床肿瘤学杂志,2001,6(3):255-256.

[7]徐建明,宋三泰,汤仲明,等.MTT体外药敏试验指导下的乳癌预见性化疗[J].中华肿瘤学杂志,1997,19(2):153-156.

[8]赵小华,张为强,蒋阳平,等.MTT法药敏试验应用于晚期乳腺癌[J].中国肿瘤,2003,12(8):479-481.

[9]汪波,张红雨,黄岩,等.改良MTT药敏分析在乳腺癌个体化治疗中的意义[J].实用癌症杂志,2004,19(2):184-185.

(收稿日期:2009-09-29)