鲶鱼体表黏液IgM的分离纯化及其抑菌活性研究

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摘要：依次采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析法从鲶鱼体表黏液中分离纯化igm，并对其抑菌活性进行了检测。通过试验可以得出，凝胶层析的最佳分离条件为：0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液、洗脱速度为0.3 mL/min。鲶鱼体表黏液中提取的IgM对大肠杆菌抑菌作用最强，其次是枯草芽孢杆菌，对藤黄微球菌抑菌效果最不明显。在低温贮存时温度控制在0～4 ℃，有助于保持其抑菌活性，但随着时间的延长，抑菌活性也会逐渐减弱。

关键词：鲶鱼；体表黏液；IgM；分离纯化；抑菌活性

中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0636-03

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）能凝集细菌，中和病毒，并能在体内其他因素的参与下彻底杀死细菌和病毒，增强机体的免疫功能[1]。免疫球蛋白可用于食品的防腐保鲜，食品中病原菌、有毒成分和功能性成分的快速检测等[2]。国内外对鱼类免疫球蛋白的研究较多[3-6]，但关于鱼类黏液中免疫球蛋白抑菌活性方面的研究却很少。本试验对鲶鱼体表黏液中的IgM进行分离纯化，并对其抑菌活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲶鱼取自天津市西青区杨柳青渔场。

SephadexG-200，Pharmacia公司产品；ELISA试剂盒，美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司产品；营养琼脂、牛肉膏、氯化钠、蛋白胨购自天津翔天科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）均由天津农学院基础部微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 鲶鱼体表黏液IgM的分离纯化 将鲶鱼皮用蒸馏水浸泡一段时间，搅拌，取上清液，用纱布将上清液过滤，去除较大的杂质，备用。取黏液后采用硫酸铵分级沉淀进行粗分离，然后再采用离子交换层析进一步分离纯化[7]。

离子交换层析后再采用凝胶过滤层析，分离参数选取如下：柱长70 cm，直径1.6 cm，流速0.3 mL/min，洗脱液分别为0.01 mol/L pH 8.0的PBS、0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl，每5 min收集1管，280 nm波长下检测，收集活性峰后冷冻干燥。将干燥后的样品配制成50 mg/L的溶液，采用ELISA试剂盒测定IgM浓度，计算纯度。选出最优洗脱液后，采用最优洗脱液进行后续参数选择。分别选取洗脱速度为0.1、0.3、0.6 mL/min，每5 min收集1管，280 nm波长下检测，收集活性峰后冷冻干燥。将干燥后的样品配制成50 mg/L的溶液，采用ELISA试剂盒测定IgM浓度，计算纯度。凝胶层析过程中，样品的吸光度越大IgM纯度越高。

1.2.2 鲶鱼体表黏液IgM抑菌活性的测定 分别选取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，检测分离纯化后的IgM的抑菌效果。革兰氏阳性菌包括藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性菌为大肠杆菌。参照杨光等[8]的滤纸片法进行抑菌试验。

制备大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的菌悬液，在无菌操作台内进行抑菌试验操作。每种菌悬液分别接种3个培养皿，用无菌涂布器将菌悬液涂布均匀。将冷冻干燥后的IgM样品配制成浓度为1%、2%、3%、4%、5%的抑菌液，滤纸片分别在上述不同浓度的抑菌液中浸泡1 min，取出晾微干，空白对照不做任何处理，每个培养皿均匀放置6个滤纸片。然后将培养皿倒置于恒温箱中，37 ℃培养24 h，观察各培养皿的变化情况。

1.2.3 鲶鱼体表黏液IgM最小抑菌浓度（MIC）的确定 由试验1.2.2得出鲶鱼体表黏液IgM对大肠杆菌的抑菌效果最好，对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌效果不明显，因此，针对大肠杆菌进行最小抑菌浓度试验。用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养大肠杆菌。将冷冻干燥后的IgM配制成浓度为0.13%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%的样品溶液。在各培养皿内分别加入2 mL不同浓度的样品溶液，每个浓度重复3次。向各培养皿内倒入15～20 mL培养基，轻轻摇动使其充分混匀。待冷却凝固后，向各培养皿内加入0.2 mL菌悬液，涂匀，用蒸馏水作对照。37 ℃恒温培养24 h，取出观察结果。以完全没有菌落生长的样品溶液最低浓度为最小抑菌浓度。

1.2.4 不同贮藏温度下鲶鱼体表黏液IgM的抑菌活性变化 试验共进行30 d。将冷冻干燥后的IgM配制成5%的样品溶液，分别贮存于0～4 ℃、20～25 ℃条件下，于1、8、15、22、29 d测定IgM的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 IgM分离纯化结果

鲶鱼体表黏液经离子交换层析后进行凝胶层析，采用ELISA试剂盒检测IgM浓度，通过跟踪测试，在第一个洗脱峰中有集中反应。收集活性峰，采用ELISA试剂盒测定IgM浓度并计算纯度。由图1可知，2种缓冲液分离纯化后的IgM纯度差距不大，但0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl（纯度82.83%）的洗脱效果要略好于0.01mol/L pH 8.0的 PBS（纯度76.35%）。因此，采用0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl作为分离纯化的洗脱液。

收集活性峰，采用ELISA试剂盒测定IgM活性成分计算纯度。由图2可知，洗脱速度为0.3 mL/min时IgM纯度最高，纯度为83.27%，确定分离纯化的最佳流速为0.3 mL/min。因此，分离纯化的最佳缓冲液为0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl，洗脱速度为0.3 mL/min。

通过硫酸铵分级盐析提取得到的IgM为粗分离产品，其纯度较低，不能满足用于制备较高纯度样品的要求，经盐析沉淀后还需采用离子交换层析和凝胶层析以获取纯度较高的IgM。离子交换法具有浓缩效果，可用于IgM的大量制备，但是通常情况下分离效果较凝胶过滤法差，要得到纯度较高的IgM一般还要结合凝胶过滤法联合使用，如王先磊等[4]采用DEAE-纤维素-52离子交换结合Sepharose 6B凝胶层析分离纯化牙鲆血清IgM。本试验在离子交换层析后再经过凝胶过滤层析，IgM样品纯度得到很大提高，纯度达83%以上，这与陈垚等[9]分离纯化鲫鱼血清IgM得到的纯度（80%）相近。

2.2 鲶鱼体表黏液IgM的抑菌活性

不同浓度的IgM对3种细菌抑菌效果如表1所示。从表1可以看出，鲶鱼体表黏液IgM对大肠杆菌的抑菌效果最好，这可能是由于所提取的IgM主要是针对大肠杆菌的原因。随着IgM浓度的增加，IgM对枯草芽孢杆菌也表现出了一定的抑菌效果，但是抑菌作用不明显，可能是由于所提取的IgM针对这种指示菌的特异性抗体含量低的原因所致。对藤黄微球菌的抑菌效果最弱。

2.3 鲶鱼体表黏液IgM的最小抑菌浓度

鲶鱼体表黏液IgM对大肠杆菌的抑菌效果最好，因此，选用大肠杆菌进行最小抑菌浓度测定试验，结果如表2所示。由表2可以得出，鲶鱼体表黏液IgM对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.50%。

2.4 不同贮藏温度下鲶鱼体表黏液IgM的抑菌活性变化

不同贮藏温度下，鲶鱼体表黏液IgM的抑菌活性变化如图3所示。由图3可知，在0～4 ℃条件下贮藏时IgM具有较强的抑菌活性，随着贮存时间的延长，IgM的抑菌活性逐渐下降，但下降幅度不大；在室温（20～25 ℃）条件贮藏8 d时IgM抑菌作用明显，但之后抑菌活性迅速减弱，至试验结束时基本无抑菌效果。试验结果表明，低温贮存有助于维持IgM的抑菌活性，长时间在室温条件下保存会破坏IgM的抑菌活性。

3 小结与讨论

本试验结果表明，IgM对大肠杆菌的抑菌效果最好。从鲶鱼体表黏液中提取的IgM的抑菌活性对目标菌有选择性，这种选择性普遍存在，如Hjelmeland等[10]在虹鳟体表黏液中纯化出的蛋白酶对革兰氏阴性菌有较强的杀菌作用；鱼精蛋白提取物对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，但对霉菌没有抑菌作用[11]；蜂胶提取物对革兰氏阳性菌的抑菌作用比革兰氏阴性菌强[12]。不同种类的鱼其体表黏液中的IgM对各种微生物表现出的抑菌性能不同，这种差异与其生活的水体环境有关，因为IgM是机体特异性免疫的产物，是针对环境中的特异性抗原物质（包括病原菌）而产生的。然而，当水体环境改变时，鱼体表黏液中的IgM的特异性是否改变，还有待进一步研究，这对IgM的具体应用具有指导意义，可避免应用的盲目性。IgM对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.50%。经试验发现，虽然IgM对革兰氏阴性菌大肠杆菌抑菌效果很好，但对革兰氏阳性菌的抑菌效果都不理想，IgM的抑菌作用表现出一定的局限性，其原因还有待进一步研究。

参考文献：

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