五峰马里兰烟空茎病病原鉴定
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摘要：在实验室对从五峰马里兰烟空茎病病株分离的病原菌进行了形态学观察、致病性鉴定和部分生物学特性研究。结果表明，分离物在LB培养基上的菌落淡黄色，圆形或不定形，表面光滑，微凸起，半透明，边缘整齐。在电镜下观察，菌体短杆状，大小（0.5～1.0） μm×（2.2～3.0）μm，周生鞭毛2～8根，无荚膜，不产生芽孢，革兰氏染色阴性。在结晶紫果胶酸盐（CVP）培养基上产生杯状凹陷。病菌能在5%盐浓度下生长，能在37 ℃下生长，能利用蔗糖发酵产酸，兼性厌氧，能利用柠檬酸盐，但不能产生吲哚。结合该菌形态学特征、致病性和部分生物学特性，初步确定引起五峰马里兰烟空茎病的病原为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）。
关键词：五峰马里兰烟；烟草；空茎病；病原鉴定；胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种
中图分类号：S435.72 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4388-02
五峰马里兰烟是湖北省宜昌市烟草公司1981年从美国引进的低焦油含量烟草品种，现定名为五峰1号[1]，作为优质烟叶品种在五峰县推广。烟草空茎病因感染后茎干中空腐烂而得名[2]。伴随着五峰县马里兰烟种植面积的扩大，空茎病成为制约五峰县烟叶发展的一种主要病害[3]，为此，于2011年开始对其危害情况进行调查，开展病原菌鉴定、生物学特性研究。
1 材料和方法
1.1 供试材料
分离病株分别采自于湖北省五峰县付家堰乡火山村、大龙坪村烟田，选取具有典型症状的烟叶和茎干。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离纯化 切取新鲜病叶、病茎病健交界处组织， 经75%乙醇和0.1%氯化汞溶液表面消毒， 无菌水冲洗后加无菌水研磨制成悬浮液， 采用平板划线法分离[4]。分离培养采用结晶紫果胶酸盐（CVP）培养基[5]。将划线后的培养皿置于28 ℃培养箱， 2 d后出现杯状凹陷菌落。5 d后选取单个菌落在LB培养基上进行纯化培养[4]。
1.2.2 致病性测定 将分离纯化的病原菌在LB培养基上活化培养2～3 d，加5～10 mL无菌生理盐水制成菌悬液。灭菌土中栽培烟叶的幼苗长到5～6片叶时采用注射接种法进行接种，用注射器缓慢地把 1 mL液体LB 培养基菌悬液注入到伤口表面， 形成悬浮滴，以生理盐水作为空白对照（CK）。培养环境温度为28 ℃、相对湿度为90%，观察发病情况。
1.2.3 病原菌的形态鉴定 病原菌在28 ℃培养18～24 h，进行革兰氏染色，鞭毛染色采用西萨基尔鞭毛染色法[4]，置光学显微镜和电子显微镜下观察。
1.2.4 病原菌的生理生化测定 对病菌进行耐盐性、碳水化合物利用、柠檬酸盐利用，吲哚试验和37 ℃下生长试验等测试，方法参照文献[6]。
2 结果与分析
2.1 病原菌形态
分离物在LB培养基上的菌落淡黄色， 圆形或不定形，表面光滑，微凸起，半透明，边缘整齐。在电镜下进行观察（图1），菌体短杆状，大小（0.5～1.0）μm×（2.2～3.0） μm，周生鞭毛2～8根，无荚膜，不产生芽孢，革兰氏染色阴性。在结晶紫果胶酸盐培养基上产生杯状凹陷。
2.2 病原菌的致病性测定
接种的10株烟草（其中苗期5株，成株期5株）均先后发病。发病最快的接种后第三天即出现与田间感染病株相同症状（图2）。对照烟苗未见发病。根据柯赫氏法则进行回接试验，证明所分离病原菌是烟草空茎病致病菌。
2.3 病原菌的部分生物学特性
病原菌生物学特性的生理生化测定结果（表1）显示，所分离病菌能在5%盐浓度下生长，能在37 ℃下生长，利用蔗糖发酵产酸，兼性厌氧，也能利用柠檬酸盐，但不能产生吲哚。这些特性与黄俊斌等[7]所鉴定的魔芋软腐病病原菌的特性以及东秀珠等[8]对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）的描述相一致。
3 结论
根据病原菌分离物的菌体形态特征及部分生理生化特性，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和参考文献[9]描述的特征，可以初步确定导致五峰马里兰烟感染空茎病的病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种（胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种， Erwinia carotovora subsp. carotovora， Ecc）[10]，与文献[11]的报道一致。经南京农业大学植物病原分子生物学实验室对分离物进行16 S rDNA 序列测定及NCBI Blast比对，其序列与Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum菌株相似度为99%，进一步确认五峰马里兰烟空茎病的病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种。
参考文献：
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[11] 甘发林，张宏健，余君山，等.兴山县烟草空茎病的发生原因及防治技术[J].湖北植保，2004（6）：14-15.