酶法辅助提取红旱莲中总黄酮工艺优化
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摘要：优化酶法辅助提取红旱莲（Hypericum ascyron L.）中总黄酮的工艺。通过单因素试验和正交试验，研究酶解温度、pH、酶用量和酶解时间对总黄酮提取量的影响。结果表明，酶法提取红旱莲中总黄酮的最佳工艺条件为酶用量1.5%，酶解温度35 ℃，酶解时间1.0 h，pH 5.2，总黄酮提取率可达13.26 mg/g，比直接超声法提取提高了10.2%。
关键词：红旱莲（Hypericum ascyron L.）；纤维素酶；总黄酮；提取；正交试验
中图分类号：R284.2；S661.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5285-03
Optimization for Extracting Total Flavonoids from Hypericum ascyron L. by Enzyme Assisted Method
FENG Hai-yan，REN Lei，LEI Ni，CHANG Yong-fang，YANG Jia-jia
（School of Chemical Engineering， Shijiazhuang University， Shijiazhuang 050035， China）
Abstract： The extracting process of the total flavonoids from Hypericum ascyron L. by enzyme assisted method was optimized. On the basis of single factor tests and orthogonal experiment， the effects of enzymatic treatment temperature， pH value， enzyme dosage， and enzymatic treatment time on the total flavonoids content were studied. The results showed that the optimal enzymatic extracting process of total flavonoids were enzyme dosage 1.5%， enzymatic temperature 35 ℃， enzymatic time 1.0 h， and pH value 5.2， and the total flavonoids content reached 13.26 mg/g， 10.2% more than that by ultrasonic extraction method.
Key words： Hypericum ascyron L.； cellulase； total flavonoids； extraction； orthogonal experiment
红旱莲系藤黄科（Guttiferae）金丝桃属（Hypericum）植物黄海棠（Hypericum ascyron L.）的全草，主要分布在我国东北地区，黄河、长江及珠江流域，性寒，味微苦，具有凉血止血、清热解毒的功效，民间用于止血，治疗黄疸、肝炎等病症[1]。近年来研究发现，该植物富含芦丁、槲皮素、金丝桃苷等黄酮类物质，还可用于抗抑郁症、抗病毒、抗癌等[2，3]。中药活性成分的含量与提取工艺有很大关系。已有研究将乙醇热回流法[4，5]和超声波法[6]用于红旱莲总黄酮的提取。酶法提取是近年来应用较广泛的一种植物有效成分提取新技术，具有反应特异性高、条件温和、易于控制、能保持生物活性等优点[7]。本研究应用单因素试验和正交试验优化纤维素酶辅助提取红旱莲中总黄酮的方法，以期为红旱莲药材的工业化开发和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
红旱莲（安国市冷背药材有限公司，经石家庄学院化工学院生药教研室岳红坤副教授鉴定为Hypericum ascyron L.）；芦丁（中国药品生物制品检定所）；纤维素酶（国药集团化学试剂有限公司，酶活力≥150 000 U/g）；其他试剂均为分析纯；水为石英高纯水。
UV/VIS-916型紫外分光光度计（澳大利亚GBC科学器材有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；YJ501型超级恒温器（上海跃进医疗器械厂）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取芦丁对照品11.6 mg，置于50 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，即得芦丁标准溶液。分别精确量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，各置于25 mL量瓶中，加0.1 mol/L三氯化铝溶液3 mL，pH 4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液5 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以试剂空白作参比，在414 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，芦丁浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为A=0.021 7+39.517 5 C，r=0.999 6。
1.2.2 红旱莲总黄酮提取率的测定 精确量取2 mL样品液至25 mL量瓶中，按“1.2.1”的方法操作，在414 nm处测定吸光度，根据回归方程计算总黄酮浓度，根据公式计算红旱莲总黄酮的提取率。
提取率（mg/g） =
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1.2.3 单因素试验 分别考察酶解过程中酶解温度、pH、酶用量及酶解时间对红旱莲总黄酮提取率的影响。①酶解温度。取 6 份干燥红旱莲粉末各1.0 g，加入pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液12 mL，酶用量为1.0%（以红旱莲质量为基础），酶解温度分别为35、40、45、50、55、60 ℃，酶解时间 2 h。②pH。取 6 份干燥红旱莲粉末各 1.0 g，分别加入pH 为3.8、4.2、4.6、5.0、5.4和5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液12 mL，酶用量1.0%，酶解温度45 ℃，酶解时间 2 h。③酶用量。 取 6份干燥红旱莲粉末各 1.0 g，加入pH 5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液12 mL，酶用量分别为 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，45 ℃酶解2 h。④酶解时间。 取6 份干燥红旱莲粉末各 1.0 g，加入pH 5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液12 mL，酶用量为1.0%，酶解温度 45 ℃，酶解时间分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h。各单因素试验酶解反应完成后，将提取液煮沸 3 min，使酶灭活。加入28 mL无水乙醇，于60 ℃超声波清洗器中提取1 h，过滤，转移滤液至 50 mL容量瓶定容，测定 A414 nm，计算总黄酮提取率。
1.2.4 正交试验 在单因素试验的基础上，确定每个因素的3个水平（表1），进行L9（43）正交试验。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶解温度对红旱莲总黄酮提取率的影响 随温度的升高，红旱莲总黄酮提取率提高，45 ℃时总黄酮提取率最高，继续升高温度，总黄酮提取率迅速降低（图1）。这是因为升高温度对酶解反应具有双重影响：一方面会提升酶的活性，加快反应速度；另一方面温度过高会降低酶的活性，甚至失活，同时还可能引起已溶出黄酮的部分分解[8]。所以选择45 ℃为纤维素酶的最适酶解温度。
2.1.2 pH对红旱莲总黄酮提取率的影响 红旱莲总黄酮提取率随pH的升高，明显提高，但当缓冲溶液pH高于5.4时，总黄酮提取率又开始下降（图2）。这说明纤维素酶处于pH 5.4的弱酸性环境时，能发挥其最高活性。继续增大或减小pH，都会引起酶活性不同程度地降低，酶解反应速度相应减缓，所以选择pH以5.4左右为宜。
2.1.3 酶用量对红旱莲总黄酮提取率的影响 红旱莲总黄酮的提取率随酶用量的不同而不同（图3），其先随酶用量的增加而迅速上升， 1.0%时达到最大，为12.93 mg/g，此后又逐渐降低。酶用量对反应速度的影响具有饱和现象，超出合适用量，酶的催化作用不但不会加强，还会受到抑制，从而影响总黄酮提取率[9]。本试验条件下，纤维素酶最佳添加量为1.0%。
2.1.4 酶解时间对红旱莲总黄酮提取率的影响 由图4可以看出，酶解2.0 h基本完成，即达到最佳提取红旱莲总黄酮的效果，继续延长反应时间，提取率反而下降。这是因为酶解产物浓度的增加，对纤维素的水解产生抑制作用[8]。本试验以酶解时间2.0 h为宜。
2.2 正交试验结果
正交试验结果见表2。由表2可知，酶解时间对红旱莲总黄酮提取率影响最大，各因素的作用强度从大到小依次为酶解时间、酶用量、酶解温度、pH。酶法辅助提取红旱莲总黄酮的最佳工艺条件为A1B2C2D1，即酶解温度35 ℃，pH 5.2，酶用量1.5%，酶解时间1.0 h。这与单因素试验得出的最佳工艺条件不同，说明多因素作用时各因素间存在相互影响和交互作用。
2.3 验证试验结果
按照上述确定的最佳工艺条件，进行验证试验，以不加酶为对照，3次重复，结果列于表3。最佳工艺条件下，红旱莲总黄酮的提取率为13.26 mg/g，高于正交试验中的各组合试验结果，与直接超声提取法相比，纤维素酶解预处理可明显提高红旱莲总黄酮的提取效果，提取量增加了10.2%。
2.4 方法学考察
精密度试验：取同一供试品溶液，按照“1.2.2”的方法测定吸光度，平行操作6 次，计算得到吸光度RSD为0.07%（n=6）。
重复性试验：在相同条件下，将同一批样品制成6份样品溶液，分别测定总黄酮提取率，平均值为12.93 mg/g，RSD为0.87%（n=6）。
稳定性试验：按照样品测定方法操作，分别在10、20、30、40、50、60 min 测定同一样品溶液的吸光度，计算 RSD为0.38%（n=6），结果表明样品提取液中的总黄酮在1 h内稳定。
回收率试验：精确称取已知总黄酮含量的红旱莲粉末，共6份，分别加入与样品总黄酮含量80%、100%、120%相当的芦丁对照品溶液，按“1.2.3”的方法操作，按照“1.2.2”的方法测定，计算总黄酮含量，回收率分别为101.2%、103.5%和107.3%，平均回收率为104.0%。
3 小结与讨论
测定植物总黄酮含量的方法主要是Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色法，但此法有一定局限性，当植物中含有山柰酚、橙皮苷、绿原酸、咖啡酸等化合物时不宜采用该方法测定[10]。旱莲、红旱莲药材中含有山柰酚、绿原酸成分[11，12]，若采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色法，测定误差较大，故本试验采用AlCl3-醋酸盐缓冲溶液比色法对红旱莲中总黄酮提取率进行测定，并对其精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行了考察。
红旱莲药材中纤维素含量较高，可能是影响总黄酮溶出的主要因素。加入纤维素酶，可特异性地降解纤维素，破坏细胞壁，从而使细胞内物质更大程度地溶出。本试验采用绿色木霉产纤维素酶用于红旱莲总黄酮的提取，并优化出酶法辅助提取的最佳工艺条件：按酶用量1.5%加入红旱莲干粉中，在pH 5.2、温度35 ℃下，酶解1.0 h后，再超声提取，总黄酮提取率可达13.26 mg/g，比直接超声提取提高了10.2%，为红旱莲黄酮类化合物的开发提供了一种新的有效方法。
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