99mTc示踪法初步研究注射NGF家兔药代动力学

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作者：付昌文，吕天润，曹小建，刘 军

【摘要】 目的 使用99mtc示踪初步研究注射用NGF在家兔体内药代动力学。方法 将NGF用99mTc标记，利用同位素示踪法和TCA沉淀法测得NGF含量与放射性计数的线性关系，并由静脉注射至家兔体内，通过上述检测方法得到不同时段血浆中微量NGF浓度，使用3P87软件分析药代动力学参数并初步分析组织分布。结果 NGF静脉注射后的家兔体内代谢符合二隔室分布模型；按剂量40μg/kg静注后，测得T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－1。结论 99mTc具有较好的示踪效果，适用于体内药代动力学研究。

【关键词】 99mTc-NGF；药代动力学；TCA沉淀法

【Abstract】 Objective To study the pharmacokinetics of NGF in rabbit by isotopic tracing. Methods NGF was labeled with99mTc，and its γ-ray counts was detected by isotopic tracing and trichloroacetic acid ( TCA) precipitation method. From cpm of γ-ray and NGF content of samples， the standard curve was drawn and it was nearly a line.99mTc-NGF was injected into rabbit(n=30) body from vena auris . Samples of rabbit blood were collected in different time (0.00833， 0.0166， 0.05， 0.0833， 0.166， 0.25， 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4h). The techniques above were used to detect NGF concentration in rabbit blood and data were inputted into computer to analysis the pharmacokinetic parameter by software (3P87). Results The metabolism in vivo conforms the double-compartments model. With the dose of 40μg/kg， the pharmacokinetics parameters were as the follows： T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－1。 Conclusion The mark of 99mTC has better effect on pharmacokinetic research of nerve growth factor.

【Key words】 99mTc-NGF； pharmacokinetics； TCA

神经生长因子（NGF）是神经营养因子家族中最重要的生物活性物质，其对神经元的生长、发育、分化、再生和功能表达具有重要的调控作用。现阶段其在应用上已经公认对脑和脊髓损伤、早老性痴呆［1～3］、糖尿病周围神经性疾病［4］等有很好效果。发现者Stanley Cohen和Rita Levi-Montalcini于1986年获得诺贝尔医学奖［5］。有关NGF的血药浓度检测已有很多报道，但都比较复杂。本文将NGF用99mTc标记，利用同位素示踪法和TCA沉淀法测得NGF含量，从而初步研究NGF脂质体在家兔体内药代动力学，以期为其他相关试验及今后的临床应用提供必要的参考资料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

GC-911γ射线计数仪（中国科技大学仪器厂）； Ultrospec2000紫外分光光度仪(Pharmacia公司)； DFM-96多排放射免疫计数仪（众成电机技术公司）； FJ-391A1型活度仪（北京放射性仪表厂）； 3P97软件(江苏省人民医院药剂科合作提供)； FA1004电子天平（上海精科天平）。

1.1.2 试剂

小鼠颌下腺2.5S NGF（南京军事医学研究所提纯，纯度>98%，文章另发）；99mTcO4(北京原子高科核技术应用股份有限公司)； 亚锡（上海化学试剂三厂）； Kieselgel 60 F254 硅胶板（德国EM science）； 柠檬酸缓冲液（南京森科医药公司）； 三氯乙酸（南京生兴生物技术公司分装）； Sephadex G-25(南京森科医药公司提供)。

1.3 实验动物 实验用新西兰兔(雌雄各半、2.5kg，南京爱立默动物实验有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 同位素示踪法与TCA沉淀法检测血浆中微量NGF 用放射性元素99mTc标记NGF，对99mTc-NGF用TCA沉淀［6］，然后对沉淀物进行γ计数仪计数，数值与NGF的含量存在线性关系，从而测定在血浆中微量NGF的浓度。

1.4.1.1 标准曲线的制备 99mTc－NGF的制备：配制0.5％亚锡（Sn2＋）－柠檬酸缓冲液（cit）。取NGF20ml（含20mg NGF）、cit溶液100ml及配制的0.5％Sn2＋-cit溶液20ml，将其置于小瓶中，充入氮气3～5min，即制备完药箱置于4℃冰箱待标记时取出。加10mgVitC于cit溶液中，制备成10mg/mlVitC溶液；取出制备的药箱，在其小瓶中加0.3ml 高锝酸（99mTcO4）(具体放射量根据需要)，然后加入配制的10mg/mlVitC溶液0.1ml，混匀。即制备完99mTc－NGF。

样品经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化，收集各组分，测量每管的γ计数，合并各峰收集组分并取出60μl，加考马斯亮蓝R-250染色，用紫外分光光度仪测定595nm处的吸光度，计算NGF的化学量。以收集99mTc-NGF峰的总放射性除以上样层析时的总放射性，即得99mTc-NGF的标记率。99mTc-NGF峰的总放射性除以该峰的总蛋白质量，即得比活度。纸层析法测定99mTc-NGF的放化纯度。

配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于试管中，加150μl生理盐水及30μl兔血清，加20％三氯乙酸200μl，5000rpm离心3min。去上清，测定各试管中沉淀物放射性计数，绘制标准曲线，求回归方程及回归系数。

1.4.1.2 测定方法的确证 通过检测回收率及重复性试验研究证明该方法的可行性。(1)回收率的测定：配置99mTc-NGF浓度为250、500、750ng/ml各5份，然后按照上述方法（标本处置同标准）测定实测99mTc-NGF的浓度；共进行5次计算该方法及线性关系回收率。每次测定前同时测定标准品沉淀物的放射性计数并绘制标准曲线以去除核素衰变影响。(2)精确度的测定：配制成浓度为250、500、750ng/ml的99Tc-NGF样品各5份，按照上述方法（标本处置同标准）测定NGF浓度，每个浓度一天内重复测定5次，计算日内相对标准偏差；每天测定1次，连续5天测定，计算日间相对标准偏差，测定当日重新标记和配制标准液。

1.4.2 实验方法

操作当日标记99mTc－NGF，按上述方法测定放化纯度和比活度。取5只等重健康家兔（2.5kg，雌雄各半），静脉注射ngf，剂量均为40mg/kg。快速于一侧耳缘静脉注射后，压迫止血，立即于另外一侧耳缘静脉用采血针头从近心端向远心端分别于30s、1min、3min、5min、10min、15min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h及4h采血，采血时使用20ml定量毛细虹吸管吸取血样，快速将血液加入内有1ml生理盐水的试管中，然后再加入20％三氯乙酸0.5ml，5000rpm离心3min。去上清，沉淀物封口保存后待统一测定。

1.4.2.1 血药浓度的测定 待所有血样和标本采集完成后，配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于试管中，按（方法参照99mTc-NGF的制备）处理标准品后，沉淀物与处置后的待测样本同时置于多样本放射免疫计数仪中，测定各试管中放射性计数，绘制标准曲线，并测定各血样的放射性计数。将计数带入标准曲线即相应的血药浓度。

1.4.2.2 静脉推注NGF在家兔体内药代动力学参数的分析 将所测定的NGF在家兔体内不同时间的血药浓度输入计算机，用3P87 软件分析药代动力学参数及房室模型。

2 结果

2.1 标记率为98.7%，比活度为30mCi/mg，放化纯度>99%。

2.2 配制10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml99mTc-NGF溶液各1份，各吸取20ml于试管中，加150μl生理盐水及30μl兔血清，加20％三氯乙酸200μl，5000rpm离心3min。去上清，测定各试管中沉淀物放射性计数，绘制标准曲线，求回归方程及回归系数。

2.3 经测定，标准曲线为y=454.41x+9169.6 (x值为NGF浓度)，R2＝0.9949。

将所测定血样放射性计数经曲线方程处理后得到相应血药浓度，血药浓度经3P87软件分析后根据F检验和AIC值选择相应房室模型为二室模型为宜并得到药代动力学参数。结果见表1。 表1 静脉注射99mTc－NGF兔体内药代动力学参数

注：n＝5

结果显示：当给药剂量为40μg/kg时，NGF药动学参数为T1/2α=0.077h、T1/2β=0.88h、AUC=98.6514ng·h·ml－1。

3 讨论

检测血液中NGF浓度常用方法有ELISA、HPLC等，这些方法灵敏度和精确度均较高，相关文献很多，但是操作繁琐，费用较高，影响结果因素较多。本实验在选择同位素示踪法来检测NGF血药浓度，此方法通过放射性原理避免了对NGF的检测方面的影响。

同位素示踪常用核素有125I、99mTc等，125I半衰期长较为稳定，但标记率很低，且对环境和同位素防护及处理要求非常高，因此在使用时收到很多限制；99mTc标记率高［7］，同位素处理简单，对人员身体影响小，但半衰期短，对检测时间要求相对较高。本实验中笔者通过99mTc标记NGF，使用TCA沉淀法及同位素示踪法进行血液中微量NGF浓度检测，通过药代动力学相关参数分析，证明静脉注射NGF在小鼠体内的药代动力学符合双隔室模型，是一种很好的药物代谢研究方法。

【参考文献】

1 Boado RJ， Tsukamoto H， Pardridge WM.Drugs delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimer’s disease and cerebral AIDS.Journal of Pharmaceutical Sciences， 1998，87(11)：1308-1315.

2 Tamai I，Tsuji T. Transpoter-mediated permeation of drugs across the blood-brain barrier. J Pharma Sci， 2000， 89（11）：1371-1888.

3 Gustilo MC， Alicja L， Markowska AL，et al. Evidence that nerve growth factor influences recent memory through structural changes in septohippocampal cholinergic neurons. J Comp Neurol， 1999，405：491-507.

4 柳川. 糖尿病周围神经病与神经生长因子.国外医学·药学分册，1998，（788）：87-94.

5 丁玄宙.1986年诺贝尔生理学或医学奖：神经生长因子和表皮生长因子的发现.生理科学进展，1987，18 (2)：191.

6 姜国辉，唐刚华，张云. 神经生长因子的药代动力学研究. 中国药学杂志，2000，35(3)：181-184.

7 李永健，孙其薰. 放射性药物与标记化合物. 北京：科学出版社， 1996，40-45.