锰超氧化物歧化酶转染间充质干细胞对糖尿病足伤口的愈合作用

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇锰超氧化物歧化酶转染间充质干细胞对糖尿病足伤口的愈合作用范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要] 目的 阐明锰超氧化物歧化酶（MnSOD）转染间充质干细胞（MSC）对糖尿病足（DF）的治疗作用和机制，为干细胞技术治疗疾病奠定研究基础。方法 链脲佐菌素法建立C57BL/6J小鼠糖尿病足模型，分别以2×104 MSC的实验组（pcDNA3.1-MnSOD转染MSC）、空白质粒组（仅转染pcDNA3.1）和对照组（未转染者为MSC）进行局部注射治疗，在7、14 d观察伤口愈合情况，并分别切取皮肤组织，进行CD34免疫组化染色，观察血管密度变化，ELISA法检测各组观察点的匀浆皮肤组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽氧化还原酶（GSHPX）变化。 结果 与空白质粒组相比，MnSOD-MSC实验组伤口愈合明显加快，差异有统计学意义（P

[关键词] 锰超氧化物歧化酶；间充质干细胞；自由基；糖尿病足；血管

[中图分类号] R730.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）05（b）-0017-03

据国际糖尿病联盟（IDF）预测，2035年全球糖尿病患者将增加到5.92亿[1]。活性氧增加是糖尿病高血糖损伤脏器的原因之一[2]，活性氧积累会使细胞损伤和伤口新生血管障碍，直接导致肢体皮肤缺血溃疡，发生在下肢的缺血性溃疡为糖尿病足（DF），该病发病率为13.5%～16.7%，致残率为1‰～2.1‰，严重危及患者生命[3]，目前移植MSC到糖尿病伤口，可以通过促血管新生、毛囊再生等途径促使伤口愈合[4]，但是MSC自身也受到高血糖的影响，如何在高血糖条件下，促进MSC抗自由基作用，发挥MSC的治疗效果，是值得探讨的重要课题，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽氧化还原酶（GSHPX）等物质，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和铁超氧化物歧化酶（FeSOD）等是重要的SOD家族成员，MnSOD在SOD家族中发挥重要作用，但是高糖条件下通过MnSOD逆转自由基损害，发挥对MSC的保护作用研究较少[5]。该研究于2012年9月―2013年2月进行试验研究，阐明MnSOD转染的MSC对抗氧化应激反应的能力，探索MnSOD-MSC促进糖尿病足愈合的效果，对促使MSC细胞疗法的临床应用广泛开展具有重要经济意义和社会效益，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人脐带血间充质干细胞（MSC）购自广州赛业生物有限公司（广州，中国）。用含10% 胎牛血清（FBS，Gbico，USA），1μmol/L青霉素，100 U/mL链霉素（Sigma）的α-MEM基本培养基培养MSC，第3～4代进行实验。分别在α-MEM基本培养基中培养MnSOD转染的MSC实验组、pcDNA3.1空质粒转染的MSC对照组、未转染的MSC空白对照组，各组实验条件相同。

1.2 MnSOD基因转染MSC

上海生工生物有限公司设计MnSOD基因引物。pcDNA3.1-MnSOD由该实验室构建保存并提取质粒DNA。添加500 μL 1%DNA-Lipofectamine2000，孵育48 h，PBS清洗，提取蛋白质，Western blot检测MnSOD基因的表达。

1.3 动物模型的建立

动物实验得到齐齐哈尔医学院伦理委员会批准。按文献记载[6]，选择6周龄，体重（21.5±0.5）g的雄性C57BL/6J小鼠（齐齐哈尔医学院动物实验中心提供），以40 mg/kg链脲佐菌素，连续5 d腹腔注射，于7、14、21、28 d尾静脉检测血糖，空腹血糖持续>16.9 mmol/L为糖尿病小鼠；糖尿病模型成功后，显微外科手术分别结扎股动脉起点和在膝关节处的分支，多普勒超声在体检测股动脉丧失血液供应，即为结扎股动脉成功，然后在小鼠大腿后部做一个5×5 cm的圆形皮肤全层缺损，建立糖尿病足模型，模型鼠在恒温、恒湿的代谢笼中单独饲养[6]。

1.4 糖尿病足的治疗以及取材

2×104 MSC、MnSOD-MSC、pcDNA3.1-MSC在糖尿病足伤口周围3、6、9、12点位置注射，3、7、10、14 d观察愈合效果并取材，每块组织分为两份，一份用4%多聚甲醛溶液固定用于免疫组化等实验，另一份在-80 ℃保存待用。

1.5 糖尿病足伤口修复率

在治疗后3、7、10、14 d，固定焦距、光圈等参数，以尼康D90数码相机（日本）拍摄伤口，并以IPP图像软件测量伤口面积，计算伤口修复率[6]。伤口修复率=1-[各观察点（3、7、10、14 d）测量伤口面积/ 0 d伤口面积]×100%

1.6 GSHPX、SOD检测

收集-80℃保存的各组皮肤组织，0.01 mol/LPBS清洗2遍；冰浴下，用3 mL 50 mM Tris缓冲液（pH=7.5，含1 mM EDTA，10mM DTT，0.2% Triton X-100）裂解细胞；4 ℃，12 000×g，上清液使用Endogen公司生产的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽还原氧化酶（GSHPX）试剂盒测定SOD和GSHPX活性[7]。

1.6 统计方法

每组实验至少重复3次。实验数据采用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，并进行t检验。

2 结果

2.1 各组MSC表达MnSOD

Western blot检测MnSOD-MSC实验组，MSC对照组，空白质粒组MnSOD蛋白表达，发现MnSOD-MSC组有外源性MnSOD表达，而空质粒组和空白组无MnSOD蛋白表达，见图1。

■

图1 MnSOD-MSC实验组，空白质粒组，MSC对照组MnSOD表达

2.2 糖尿病足愈合情况

相比空质粒组，MnSOD-MSC实验组可以明显加快糖尿病足伤口愈合速度，差异有统计学意义（P

■

A. 各组治疗糖尿病足的治愈率（%）。MnSOD-MSC实验组与空质粒组比较差异有统计学意义，*P

图2 各组治疗糖尿病足的效果

2.3 各组SOD、GSHPX变化

空质粒组SOD、GSHPX含量较低，MnSOD-MSC实验组SOD、GSHPX含量与空质粒组皮肤组织，差异有统计学意义（P

3 讨论

糖尿病伤口延迟愈合的形成与血管匮乏，血液供应下降密切相关，虽然各种治疗手段正被用于治疗糖尿病溃疡，但是效果不甚理想，所以促进糖尿病足的愈合一直是糖尿病研究领域的热点[8]。伤口愈合时，各种组织和细胞、细胞因子等对损伤区进行填充[9]，使人们联想到干（祖）细胞的应用，间充质干细胞（MSC）属于多潜能干细胞，具有适应局部微环境，多分化的特点，MSC在心血管损伤、肾功能衰竭、神经和骨骼等许多人类疾病有广泛应用，对于DF这种兼有血管、神经等混合性病变而言，MSC移植疗法尤为合适[10]，该研究也发现利用MSC可以促使糖尿病足溃疡愈合，与学者研究的结果一致。

糖尿病性高血糖会导致动脉发生硬化变性，出现微血管梗阻，导致组织局部缺氧而坏死。高血糖乏氧损伤会通过NADPH等途径产生大量活性氧[11]，而糖尿病时高血糖状态促使体内抗氧化酶活性降低，机体清除自由基的能力受损，加重糖尿病并发症的发生，这也是糖尿病足经久不愈的原因之一[12]。文献报道糖尿病鼠皮肤MnSOD蛋白等抗氧化酶的活性显著降低[13]，该研究利用MnSOD转染MSC可以促进糖尿病足的愈合，比空转染组和对照组具有显著差别，并证明在体模型上，MnSOD可以促进MSC分泌SOD等抗氧化酶类，保证MSC对抗自由基的损伤，达到促进组织修复的目的[14]。该研究也从侧面验证提高糖尿病足溃疡周围MnSOD蛋白等抗氧化酶的含量，可以对抗自由基损伤作用，同时避免MSC等细胞免受氧自由基的伤害，提示如果利用抗氧化酶转染MSC、内皮祖细胞（EPC）等干细胞，会保护干（祖）细胞免受活性氧的伤害，最大程度发挥细胞的作用。

虽然利用MnSOD转染MSC治疗糖尿病足取得一定效果，但是关于具体机制的研究，还需要深入探索，下一步将利用Western blot、实时定量PCR等方法检测Akt等信号通路在MnSOD转染的MSC中具体机制，相关研究结果必将为在糖尿病足的干细胞疗法的普及奠定研究基础，其发挥的经济效益和社会效益非常巨大。

[参考文献]

[1] Cortez-Espinosa N， Garcia-Hernandez MH， Reynaga-Hernandez E， et al. Abnormal expression and function of Dectin-1 receptor in type 2 diabetes mellitus patients with poor glycemic control（HbA1c>8%）[J]. Metabolism， 2012， 61（11）： 1538-1546.

[2] MacDonald MJ， Langberg EC， Tibell A， et al. Identification of ATP synthase as a lipid peroxide protein adduct in pancreatic islets from humans with and without type 2 diabetes mellitus[J].J Clin Endocrinol Metab， 2013， 98（4）： E727-731.

[3] Brem H， Sheehan P， Rosenberg HJ， et al. Evidence-based protocol for diabetic foot ulcers[J].Plast Reconstr Surg，2006，117（7 Suppl）：193S-209S； discussion ，210S-211S.

[4] Phillips MI. Gene， stem cell， and future therapies for orphan diseases[J]. Clin Pharmacol Ther，2012，92（2）：182-92.

[5] Zelenyi II， Frolov VM， Peresadin NA. Effectiveness of Reamberin in correction of oxidative stress syndrome in patients with phlegmonous and gangrenous erysipelas against the background of the 2 type diabetes mellitus[J].Vestn Khir Im I I Grek，2012，171（6）： 54-56， 58.

[6] Shen L， Zeng W， Wu YX， et al. Neurotrophin-3 accelerates wound healing in diabetic mice by promoting a paracrine response in mesenchymal stem cells[J].Cell Transplant，2013，22（6）： 1011-1021.

[7] Matalka KZ， Tutunji MF， Abu-Baker M， et al. Measurement of protein cytokines in tissue extracts by enzyme-linked immunosorbent assays： application to lipopolysaccharide-induced differential milieu of cytokines[J].Neuro Endocrinol Lett，2005，26（3）： 231-236.

[8] Peters EJ， Lipsky BA. Diagnosis and management of infection in the diabetic foot[J].Med Clin North Am，2013，97（5）： 911-946.

[9] Martin P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration[J].Science，1997，276（5309）： 75-81.

[10] Dabiri G， Heiner D， Falanga V. The emerging use of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of human chronic wounds[J].Expert Opin Emerg Drugs，2013，18（4）： 405-419.

[11] Dugan LL， You YH， Ali SS， et al. AMPK dysregulation promotes diabetes-related reduction of superoxide and mitochondrial function[J].J Clin Invest，2013，123（11）： 4888-4899.

[12] Du Y， Veenstra A， Palczewski K， et al. Photoreceptor cells are major contributors to diabetes-induced oxidative stress and local inflammation in the retina[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（41）： 16586-16591.

[13] Walter MN， Wright KT， Fuller HR， et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing： an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays[J].Exp Cell Res，2010，316（7）： 1271-1281.

[14] Marrotte EJ， Chen DD， Hakim JS， et al. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice[J].J Clin Invest，2010，120（12）： 4207-4219.

（收稿日期：2014-02-13）