清热抗感冲剂对大鼠NK细胞杀伤活性的影响

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(山西中医学院，山西　太原030024)

摘要：目的：通过检测清热抗感冲剂对实验性免疫低下大鼠及正常大鼠nk细胞杀伤活性的影响，探讨该方对免疫功能的调节作用。方法：选取Wistar大鼠100只，雌雄各半，随机抽取其中雌雄各25只，腹腔注射环磷酰胺4.5mg/(0.5mL・只)，每天给药1次，连续7天，造成免疫低下大鼠，然后随机分为模型组、中药对照组(银翘解毒片组)、西药对照组(γ－干扰素组)、小剂量组及大剂量组，保证每组雌雄各半：其余50只随机分为正常空白对照组(即生理盐水组)、中药对照组、西药对照组、小剂量组、大剂量组，同样保证每组雌雄各半。上述各组连续用药3夭后，麻醉无菌操作完整摘除脾脏，置含RPMI营养液的无茵瓶中，送检。采用流式细胞仪检测NK细胞的杀伤活性。结果：清热抗感冲荆能显著增加正常大鼠和注射环磷酰胺引起的免疫低下大鼠NK细胞杀伤活性(P＜0.05或P＜0.01)。结论：清热抗感冲剂对大鼠的NK细胞杀伤活性有明显的促进作用。

关键词：中医药研究；清热抗感冲剂；免疫调节；NK细胞

中图分类号：R285　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-0929-03

清热抗感冲剂主要含有僵蚕、薄荷、金银花、连翘、板蓝根、桔梗、大黄等药物，具有辛凉解表、清热解毒、宣降蕴热的作用。临床用以治疗上呼吸道感染，有效率达94.16％，疗效显著。课题组以往的实验已经证实清热抗感冲剂具有抗病毒及提高血清lL-2、CD4+T细胞亚群的功能。为了深入研究该冲剂对免疫的调节作用，本实验主要从清热抗感冲剂对大鼠NK细胞杀伤活性的影响方面观察该冲剂的免疫调节作用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 Wistar大鼠100只，体重为(200±20)g，雌雄各半，由山西省中医药研究院实验动物中心提供，合格证号：晋动(证)字A00-002号。饲养环境通风良好，饲养温度18～22℃，湿度为45％65％。

1.1.2实验药物　清热抗感冲剂(将本方药物水煎、浓缩、真空干燥，制成冲剂，每袋6g。由山西中医学院附属医院制剂室提供)；银翘解毒片(云南省腾冲制药厂提供，批号为050169，经粉碎研磨100目过筛制成散剂)；γ-干扰素(上海克隆生物高技术有限公司提供，批号为20050101)；环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司提供，批号为05012021)。

1.13实验试剂　体外K562细胞株(北京药物所引进)；RPMI-1640培养基(山西省肿瘤医院配制)；rh Annexin V-PE(Cat.No.BM306pe,BMS公司)；PI核酸染料(Cat.No.66211E,BD公司提供)

1.1.4实验仪器　流式细胞仪(BD FACSCalibur，美国BD公司生产)，HengpingJA2003电子精密天平(上海恒平科学仪器有限公司)，离心机等。

1.2实验方法

1.2.1试剂配制　清热抗感冲剂灌胃液的制备：取清热抗感冲剂加蒸馏水溶解，分别配制成实验所需的低浓度1.134g/2mL和高浓度2.268g/2mL银翘解毒片灌胃液的制备：取银翘解毒片粉碎后，经100目过筛，制成散剂，加蒸馏水溶解，配制成浓度为227mg/mL溶液。

γ-干扰素注射液的制备：将γ干扰素加注射用水溶解成10.8万UI/mL。环磷酰胺注射液的制备：将环磷酰胺加生理盐水配制成浓度为9mg/mL的溶液。

1.2.2分组及给药 取100只大鼠，雌雄各半，随机分成两大组：①正常组：取50只大鼠雌雄各半，再随机分成5组，并保证每组雌雄各半，分别给药如下：(1)生理盐水组：生理盐水2mL/只，灌胃。(2)中药对照组：银翘解毒片水溶液灌胃227me/(1mL・只)。(3)西药对照组：腹腔注射γ-干扰素5．4万UL/(0.5mL・只)。(4)小剂量组：清热抗感冲剂水溶液灌胃1.134g/(2mL・只)。(5)大剂量组：清热抗感冲剂水溶液灌胃2.268g/(2mL・只)。免疫功能低下组：取50只大鼠腹腔注射环磷4.5mg/(0.5mL・只)，每天给药1次，连续7天。然后再随机分成5组，每组雌雄各半，其中一组作为对照，其余4组分别给药如上述正常组(2)～(5)组。上述各组每天给药1次，连续3天。

1.2.3标本的采集 最后1次给药24h后，20％乌拉坦注射0.8mL/只麻醉后，无菌操作完整摘除脾脏，置RPMI-1640营养液内送检(与山西省肿瘤研究所合作完成)。

1.2.4靶细胞的制备　体外K562细胞株，取在RPMI一1640培养基生长旺盛的细胞计数，用完全RPMI－1640培养基调整细胞浓度为1×106备用。

1.2.5效应细胞　无菌操作解剖实验大鼠，取脾脏放入含RPMI－1640培养基的无菌瓶中，用机械法将脾细胞分离，加入适量PBS液，1000r/min离心10min后，弃上清，沉淀物加入适量溶血素混匀，室温放置10min后，1000r/min离心10min后，弃上清，沉淀物加入适量PBS液混匀，细胞计数后，1000r/min离心10min后，弃上清，用完全RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×107/mL备用。

1.2.6培养与染色　取无菌96孔培养板，加靶细胞悬液到96孔培养板，每孔100μL，再加入效应细胞到靶细胞中(效：靶=50:1)，每个脾标本加2孔，另加人单纯效应细胞和靶细胞液作为对照。振荡混匀，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育12h。将培养板中细胞收集到流式样品管中，加入适量PBS离心洗1次(1000r/min)，弃上清。样本细胞中加入5μL rh Annexin V-PE和10μL PI染料，混匀在室温(20～25℃)避光放置15min。加入PBS液500μL，混匀，1h内上流式细胞仪测定。

1.3实验资料处理

所有实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，组间显著性检验采用t检验。

2结果

2.1清热抗感冲剂对正常大鼠NK细胞的杀伤活性

NK细胞总的杀伤活性可以区分为凋亡和坏死两种形式，中药对照组、西药对照组及实验药物的大、小剂量组与生理盐水组比较，凋亡和坏死均有显著性差异，可见均能提高正常大鼠NK细胞的杀伤活性，实验药物的大、小剂量组与中药对照组、西药对照组作用相似，实验药物的大剂量组与小剂量组相比，凋亡和坏死均有增高趋势，但其差异性无统计学意义。NK细胞总杀伤活性组间比较。

模型组NK细胞杀伤活性明显低于空白对照组，说明环磷酰胺可以抑制大鼠NK细胞杀伤活性，实验药物的大、小剂量组均能提高免疫抑制大鼠的NK细胞杀伤活性，作用与中药对照组、西药对照组相似，实验药物的大剂量组与小剂量组相比，凋亡和坏死均有增高趋势，但其差异性不显著。各组NK细胞总杀伤活性的比较。

3讨论

据文献报道，上呼吸道感染的人群，普遍存在免疫功能低下的现象。有资料表明，上呼吸道感染患者，多存在细胞因子活性降低等现象。而且现代医学研究认为，机体免疫系统在抗病毒感染过程中发挥着重要作用，其中包括有免疫球蛋白参与的体液免疫、SIgA为主的黏膜免疫等特异性免疫和NK细胞、IFN等非特异性免疫。

NK细胞是机体内存在的具有自然杀伤能力的细胞，是自发的细胞介导的细胞毒，作用发生快，在病毒感染早期，NK细胞即可通过趋化作用聚集到感染灶，在干扰素(IFN-α/β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-12(IL-12)等细胞因子作用下，诱导NK细胞活化，使病毒感染细胞溶解破坏，同时NK细胞分泌IFN-γ和IFN-α等，通过干扰病毒复制和进一步活化吞噬细胞，扩大和增强机体抗感染的免疫功能。NK细胞还具有免疫调节作用，可以抑制美洲商陆(PWM)诱导的B细胞增殖分化，释放IFN－γ、IFN－β和巨噬细胞／粒细胞集落刺激因子(GM－CSF)等细胞因子，对机体的免疫功能进行调节，增强机体早期抗感染的免疫能力和免疫监视作用。总之，NK细胞是机体重要的非特异性防御机能之一。本次实验研究结果显示，清热抗感冲剂可以显著提高正常大鼠以及被环磷酰胺免疫抑制大鼠的NK细胞杀伤活性。这可能是其治疗上呼吸道感染的机理之一。

4小结

本实验研究表明，清热抗感冲剂可以显著提高正常大鼠以及被环磷酰胺免疫抑制的大鼠NK细胞杀伤活性。

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