尿中盐酸曲马多的快速分析方法
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[摘要]目的：通过考察尿中盐酸曲马多及其代谢物的提取方法，建立其气相色谱-质谱(GC-MS)的检测方法。方法：采用C18固相萃取法对尿中曲马多原体及其主要代谢物进行提取，利用GC-MS对其进行检测。结果：线性范围为0.1~100μg/ml（r=0.9957，n=6），平均回收率为99.21%，相对标准偏差为2.83%，最低测量限为 0.1 g/ml 。结论：本实验研究建立了尿中曲马多及其代谢物的快速、简便、准确、灵敏的检测方法，可作为快速检测吸毒人员尿中是否含有曲马多的一种有效的方法。
[关键词]曲马多；代谢物；气相-质谱法；固相萃取
[中图分类号]O657[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）05（b）-009-03
The rapid analysis method of tramadol hydrothloride injection in urine
JIANG Wei
（Shengjing Hospital,Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China）
[Abstract] Objective：To examine the optimal extractive conditions of tramadol and its metabolite from urine and establish a detection method of tramadol by GC-MS. Methods：A solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry(SPE-GC-MS) procedure for the simultaneous detection of tramadol and its main metabolite in urine has been developed.Results：The linearity of the tramadol solution from 0.1 g/ml to 100 μg/ml is fine ,and correlation coefficient is 0.9957.The average recovery was 99.21%,and the relative sandard deviation was 2.83%.Conclusion：It is a rapid,simple,accurate and sensitive method.It is also an effective method for rapid detection whether there is tramadol in urine of druggy.
[Key words]Tramadol；Metabolites；Solid-phase extraction；Gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS)
曲马多（tramadol或tramal，TR）又名曲马朵，是由德国格兰泰公司在20世纪60年代早期开发研制的强效中枢镇痛药，并于1977年投放德国市场。在欧美国家已使用多年，对中度至重度疼痛被认为是有效且安全的[1]，由于曲马多滥用潜力极低，故国外在上市后20年的临床应用中很少发生滥用曲马多案例。但近几年来已有报道有曲马多成瘾及过量致死案例[2,3]。一些吸毒者在滥用曲马多的同时滥用安定等精神药物，据称可产生类似海洛因、度冷丁样欣[4]。我们在一些吸毒者尿样中也检出曲马多及其代谢物成分，说明吸毒者已认识曲马多的作用，须引起重视。
1 材料与方法
1.1 方法
以GC-MS法，通过对化合物的结构分析，研究曲马多裂解方式，从而为确定结构提供依据。采用内标法进行定量。即用SKF-525A作为内标物质，以样品中待测组分与内标物的峰面积比值进行计算。具体公式如下：
CTR与ATR分别代表曲马多检材的浓度及相应的峰面积。C标及A标分别代表曲马多标准溶液的浓度及相应的峰面积, A标代表内标物的峰面积。
1.2 实验材料及试剂
1.2.1 仪器美国Thermo 公司气相-质谱联用仪，固相萃取柱: MT型C18固相柱（天津市富集科技有限公司），WH-3微型旋涡混合仪（上海泸西分析仪器厂），80-2离心沉淀器（上海分析器械厂），AS-5150A型超声仪(奥特赛斯机器有限公司)。
1.2.2 试剂盐酸曲马多（中国药品生物制品检定所）；SKF-525A（内标物，公安部物证鉴定中心）；甲醇（优级纯，北京化工厂）；三氯甲烷、乙醚、环己烷、异丙醇均为分析醇。
1.3 溶液的配制
1.3.1 标准溶液配制精密称取盐酸曲马多50 mg，置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。精密量取5 ml，置50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为曲马多标准溶液备用。
1.3.2 内标溶液配制精密称取SKF-525A 5 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到内标溶液备用。
1.3.3 缓冲溶液（pH＝10.58）的配制0.05 mol/L碳酸钠与0.1 mol/L碳酸氢钠按9∶1比例混合。
1.4 尿样中曲马多萃取方法的筛选
1.4.1 液-液萃取取2 ml空白尿液，共5份，分别置10 ml离心试管中，分别添加曲马多标准溶液100 μl和内标溶液30 μl。然后用缓冲溶液调节pH值至9.5。向上述5个10 ml离心试管尿液中，分别加入4种不同的提取溶剂：氯仿∶异丙醇（9∶1，v/v）、环已烷、氯仿、乙醚提取（各加3 ml），然后置旋涡混合器上旋涡10 min，离心10 min，提取有机层，剩下的水层再用3 ml有机溶剂提取，旋涡，离心，合并有机层，并用氮气流吹干，然后用甲醇溶解并定容至0.5 ml，取0.4 μl进样 ，用GC-MS分析，测定结果见表1。
1.4.2 固相萃取固相萃取分两种情况进行实验，一种为柱前调节pH，另一种为柱上调节pH。
1.4.2.1 柱前调节pH：取2 ml空白尿液共3份，然后分别添加曲马多标准溶液500 μl和内标溶液30 μl，在尿液中添加pH 10.58的缓冲液直至pH调至9.5，用2 ml甲醇淋洗小柱使其活化并保持湿润，然后取上述3份空白尿样过柱(如果尿样浑浊,离心后取上清液，过柱)，依次用5 ml蒸馏水淋洗小柱，将其吹干，再用2 ml甲醇洗脱小柱,收集洗脱液，在氮气下吹干。最后用甲醇溶解并定容至0.5 ml，取0.4 μl进样，用GC-MS分析，测定结果见表2。
1.4.2.2 柱上调节pH：取2 ml空白尿液共3份，在尿液中分别添加曲马多标准溶液500 μl和内标溶液30 μl。先用2 ml甲醇淋洗小柱使其活化，再用pH 10.58的缓冲溶液2 ml调至碱性,使柱保持湿润，取上述3份空白尿样过柱(如果尿样浑浊,离心后取上清液，过柱)，然后依次用5 ml蒸馏水淋洗小柱，将其吹干，再用2 ml甲醇洗脱小柱,收集洗脱液，在氮气流下吹干。然后用甲醇溶解并定容至0.5 ml，取0.4 μl进样，用GC-MS分析，测定结果见表2。
1.5 回收率和准确度考察
取空白尿2 ml 15份，其中以5份为一组分成三组考察曲马多低、中、高3个浓度样品的绝对回收率。具体步骤如下：取5份空白尿，分别添加曲马多标液30 μl和内标溶液30 μl，最后用甲醇溶解并定容到0.5 ml，进样0.4 μl，用GC-MS分析。同法对30 μg/ml曲马多和50 μg/ml两组样品进样分析。本实验以经过过柱处理的曲马多溶液 在标准曲线上对应的浓度与曲马多添加浓度之比来考察3、30、50 μg/ml三种浓度曲马多的回收率与准确度（表3）。
1.6 提取回收率及精密度考察
按上述方法制得三种浓度曲马多溶液，每种5份，另外配制该3种浓度的对照品溶液各1份，测得曲马多提取回收率如表4。
按上述方法制得上述三种浓度曲马多溶液，连续测定5 d，分别得日内、日间标准偏差差异及提取回收率。结果见表5。
2 结果
2.1 曲马多（TR）质谱图特征峰m/z 58、188、218、263分别来自
M1质谱图特征峰m/z 58同TR，而特征峰121、174、204、249比TR少14质量单位为O-去甲基TR；M2质谱图特征峰m/z135、188、218同TR，而特征峰m/z44、249比TR少14质量单位为N-去甲基TR；M3质谱图特征峰m/z 58、135同TR，而特征峰m/z 234、279比TR少16质量单位为羟化TR。
2.2 根据以上实验，应用气相色谱-质谱(GC-MS)的检测方法得出的最终数据是：线性范围为0.1~100 μg/ml（r=0.9957，n=6），平均回收率为99.21%，相对标准偏差为2.83%，最低测量限为 0.1 μg/ml。
3 讨论
3.1 本实验做了对相同浓度的曲马多进行液-液提取和固相萃取时对提取回收率的比较，表1和表2提供了提取回收率的数据。
3.2 在液-液提取实验中，由于曲马多易溶于有机溶剂，因此选择对曲马多提取率较高的溶剂氯仿∶异丙醇（9∶1，v/v）、环已烷、氯仿、乙醚进行液-液提取，在GC-MS图谱中，氯仿和环己烷提取效果好，相对标准偏差较小，杂质少。由表1所示的数据显示，在无固相萃取条件时可采用氯仿和环己烷作为曲马多提取溶剂。
3.3 在用C18柱固相萃取法中，通过对碱性调节的先后得出的柱回收率的比较，我们知道在柱上调节PH值可提高方法的回收率，因此我们采用在活化后C18柱上过pH为10.58的缓冲液的方法来进行实验。
3.4在液-液提取进行涡旋时，水层和有机层之间常常出现透明的胶体，处理较麻烦，影响回收率值较大。固相萃取法比液-液萃取法有很多优点，首先使用的有机溶剂少；其次是操作方法简便，可以省去在液-液萃取中使用涡旋，离心等步骤所造成的损失，提取效果好，杂质少，大大增加了提取回收率，并且不易产生乳化现象，节省时间，缩短样品的挥干时间，而且固相萃取的回收率高于液-液萃取的回收率。
3.5 为配合禁毒工作，公安机关经常需要对吸毒嫌疑人员进行检验，认定滥用药物种类。曲马多主要经肝脏代谢，由于曲马多的半衰期短，因此吸毒人员尿液中曲马多可以以原体及主要代谢物的状态被检测出来，但由于人尿液中干扰物质较多，一般GC-MS方法很难满足检验需要。本文建立的固相萃取GC-MS法，适用于快速检验吸毒人员尿液中曲马多及其代谢物成分，方法快速、简便、灵敏、准确，可作为公安机关快速检验吸毒人是否含有曲马多的一种有效的方法。
（致谢：本实验得到了辽宁省公安厅化验室的支持，在此表示感谢！）
[参考文献]
[1]Hernabdez AF,Montero MN,Pla A,et al.Fatal moclobemide overdose or death caused by serotonin syndrome?[J].J Forensic Sci,1995,40(1):128-130.
[2]Lusthof KJ,Zweipfenning PG.Suicide by tramadol overdose[J].J Anal Toxicol,1998,22(3):260.
[3]Goeringer KE,Logan BK,Christian GD.Identification of tramadol and its metabolites in blood from drug-related deaths and drug-impaired drivers[J].J Anal Toxicol,1997,21（7）:529-537.
[4]刘志民,张开镐. 曲马多的不良反应及药物依赖性[J].药物流行学杂志，1999，8：150-152.
（收稿日期：2007-03-26）
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