外源砷对土壤微生物数量的影响研究

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摘要：通过室内模拟的方法，研究外源砷对土壤微生物数量的影响。结果表明，对经驯化后的无污染土壤而言，低浓度外源砷对异养型微生物的生长有刺激促进作用，随着浓度的增加又表现为抑制作用；在相同的外源砷浓度下，砷对自养型微生物有更强的抑制作用。微污染土壤中的微生物数量高于受砷严重污染区土壤的；而当向其中加入外源砷后，微污染土壤中的微生物数量明显减少。

关键词：外源砷；土壤；微生物；数量

中图分类号：Ｘ５３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2636-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ａｒｓｅｎｉｃ ｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ

ＳＯＮＧ Ｗｅｉ－ｆｅｎｇ，ＤＥＮＧ Ｑｉ，ＢＩＮ Ｌｉ－ｙｉｎｇ，ＸＩＯＮＧ Ｒｕ－ｙｉ

（Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｒｓｅｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａ ｑｕｉｔｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ ｓｏｍｅ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ａｒｓｅｎｉｃ （ｔｈｅ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ０ ｍｇ／ｋｇ，５００ ｍｇ／ｋｇ，１ ０００ ｍｇ／ｋｇ，２ ０００ ｍｇ／ｋｇ） ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａｕｘｏｈｅｔｅｒｔｒｏｐｈｓ ｗａｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｓｅｎｉｃ， ｂｕｔ ｉｔ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｗｈｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｓｅｎｉｃ． Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ａｒｓｅｎｉｃ， ａ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｏｎ ａｕｘｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ ｔｈａｎ ｏｎ ａｕｘｏｈｅｔｅｒｔｒｏｐｈｓ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｆ ａｒｓｅｎｉｃ， ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｕｘｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ ａｎｄ ａｕｘｏｈｅｔｅｒｔｒｏｐｈｓ ｂｏｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ａｒｓｅｎｉｃ； ｓｏｉｌ； ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ； ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ

砷是自然界分布广泛的元素，其最初来源于土壤母质，主要受火山活动所影响，在地壳中自然含量较低，约为３ ｍｇ／ｋｇ［１］。矿冶是造成高浓度砷污染的主要原因，其操作过程中不可避免地产生含砷污泥，造成二次污染［２］。从２０世纪开始，高浓度砷对地下水的污染就一直危害着全球２１个国家和地区的人们，其中受影响人数最多的国家是孟加拉国，大约有２０万～２７万人因饮用受砷污染的水而死于癌症［３］。在我国局部地区，由矿冶和化工活动造成的土壤砷污染也相当严重，有的地区土壤砷浓度高达

５ ０７０ ｍｇ／ｋｇ［４］。砷已被国内外列为优先控制的污染物，土壤的砷污染和防治一直是国际上的研究难点和热点领域。在土壤中，微生物种类很多，由于它们各自具有不同的生理习性，故能产生各种不同的作用［５］。土壤中微生物生存条件的差异，使得土壤中微生物群落的组成和数量发生相应的变化［６，７］。已有研究发现，在长期受砷污染的土壤中，微生物的生物量显著下降，一些敏感性种群数量下降或消失，而一些耐砷强的种群则得以生长和繁殖［８］。

微生物群落的组成和数量变化必将影响到土壤的功能，而耐砷菌的大量生长对砷价态和形态的变化也必将产生作用。因此，外源砷对土壤微生物数量影响的研究是一项基础工作，对于研究砷在土壤中的转化、迁移具有重要意义。本研究通过室内试验，研究了外加砷源对土壤微生物相对数量的影响，总结出关于不同浓度的砷促进与抑制土壤中微生物生长的变化规律。现将结果报道如下。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１样品来源土壤样品有３个，样品１来自广东省肇庆市鼎湖山自然保护区，在自然条件下，该样品污染少，能减少各种试验干扰因素，其自然含砷量为４．３８ ｍｇ／ｋｇ。因《土壤环境质量标准》（ＧＢ １５６１８－１９９５）中一级标准规定砷的含量在１５ ｍｇ／ｋｇ以下，所以所取土壤可以视为代表性较强的未受砷污染的土壤。样品２取自广东省北部某市受砷严重污染的土壤，其周围只有蜈蚣草得以生存，总砷为

７ ５３２．６３ ｍｇ／ｋｇ，视为受砷严重污染土壤。样品３取样自距离受砷严重污染点２～３ ｋｍ处的茶场，其土壤总砷含量为４５．６８ ｍｇ／ｋｇ，视为受砷微污染土壤。

１．１．２培养基①自养型无机盐培养基：无机盐培养基＋酵母０．１ ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３ ０．５ ｇ／Ｌ。用于土壤样品１的试验。②异养型无机盐培养基：无机盐培养基＋酵母０．５ ｇ／Ｌ、乳酸钠５ ｍｍｏｌ／Ｌ。用于土壤样品１、２、３的试验。③１０％ ＬＢ＋葡萄糖培养基：蛋白胨１．０ ｇ／Ｌ、酵母抽提物０．５ ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ ｇ／Ｌ、葡萄糖２．０ ｇ／Ｌ，用于土壤样品２、３的试验。

无机盐培养基：Ｎａ２ＳＯ４・10Ｈ２Ｏ ０．０７ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１０ ｇ／Ｌ，ＫＣｌ ０．０５ ｇ／Ｌ，ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０４ ｇ／Ｌ，

ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１７ ｇ／Ｌ，琼脂 ２０ ｇ／Ｌ，微量元素 １ ｍＬ／Ｌ，维生素 ５ ｍＬ／Ｌ。

１．２试验方法

１．２．１土壤样品驯化与保存土壤样品１：挑出石块和植物残渣后，研磨过筛，四分法取样，每份取４００ ｇ，共取４份，分别放置于４个塑料保鲜盒中，其中１份作为空白。另外称取已研磨成粉末状的ＮａＡｓＯ２ ２００、４００、８００ ｍｇ各１份分别溶解于１４５ mL去离子水中，分别加到另外３份土样中，用消毒后的竹筷搅拌使其充分混合，放置于带盖的小保鲜盒内，使得土壤含ＮａＡｓＯ２量分别为０、５００、１ ０００、２ ０００ ｍｇ／ｋｇ［９］。存放于实验室（室温）进行培养驯化，为期９０ ｄ。期间每隔一周查看土壤情况，若缺水，则及时添加去离子水。土壤样品２、３：挑出石块和植物残渣，研磨过筛，四分法取样后放置于４ ℃冰箱保存。

１．２．２样品稀释液的制备称取待测样品１ ｇ，放入装有９９ ｍＬ去离子水和几颗小玻璃珠的已灭菌三角烧瓶中，放置于摇床上振荡培养（室温、１８０ ｒ／ｍｉｎ）３ ｈ［１０］，使微生物细胞分散；再用移液枪吸取，制成１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７等一系列稀释菌液。

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１．２．３涂抹平板计数法将培养基加热熔化后倒入无菌平板中，待凝固后编号，每一号码设置３个重复。然后按无菌操作要求，用移液枪吸取１００ μＬ菌液，对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再用涂布棒将菌液均匀涂抹在平板上，每次涂抹时需先将涂布棒灼烧灭菌。将涂抹好的平板倒置放于２８ ℃恒温培养箱中培养，直至长出菌落后进行计数。将培养皿取出后用细菌计数器进行菌落计数，计算方法为：每克样品的菌数＝同一稀释度的菌落平均数×１０×稀释倍数；每克干土中菌数＝（菌落平均数×稀释倍数）／干土重×１０。

２结果与分析

２．１外源砷对经驯化后的无污染土壤中的微生物数量影响

试验中的干土重是通过湿土在１０５ ℃烘箱中烘干后得到的，按ＮａＡｓＯ２浓度递增顺序，添加不同浓度ＮａＡｓＯ２进行驯化的每克湿土壤的干土重分别为０．８０４、０．７５５、０．８８６、０．８２６ ｇ。土壤驯化后，在不同的外源砷浓度下，微生物数量见图１、图２。由图１、图２可知，每克干土中，自养型微生物在空白对照土壤中的数量最多，为９．３×１０７个；其次为含ＮａＡｓＯ２

２ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有３．３×１０７个；接着是含ＮａＡｓＯ２５００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有２．１×１０７个；含ＮａＡｓＯ２

１ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤最少，为２．５×１０６个。每克干土中异养型微生物的数量最多的是含ＮａＡｓＯ２ ５００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有２．８×１０８个；其次为空白对照土壤，为７．１×１０７个；再者为含ＮａＡｓＯ２ ２ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，有５．６×１０７个；最少的是含ＮａＡｓＯ２ １ ０００ ｍｇ／ｋｇ的土壤，为１．８×１０７个。

对图１和图２进行对比发现，未添加外源砷前，自养型微生物和异养型微生物在土壤中的数量相差不大，每克干土中分别有９．３×１０７、７．１×１０７个。但当加入不同浓度的外源砷后，砷对自养型微生物有明显地抑制作用。３个浓度梯度下的自养型微生物数量均低于异养型的，反映出砷对自养型微生物的抑制作用大于其对异养型微生物的作用，从另一个侧面也说明异养型微生物的抗砷能力更强。此外，异养型微生物数量在外源砷添加浓度为５００ ｍｇ／ｋｇ时出现了明显的增加，这表明低浓度砷对异养型微生物生长有刺激促进作用，随着浓度的增加，又表现为抑制作用。在相同的外源砷浓度下，砷对自养型微生物有更强的抑制作用。但无论是自养型还是异养型，在砷的抑制作用下，微生物数量均表现为先减少后增加的趋势，这说明不适应砷的微生物先大量减少或灭绝；当外源砷的浓度达到

２ ０００ ｍｇ／ｋｇ时，能适应环境存活下来的耐砷菌便开始大量繁殖，表现为微生物数量的增加。

２．２外加砷对已受砷污染土壤的微生物数量的影响

由图３可知，在无砷的有机培养基中，微污染土壤的微生物数量高于受砷严重污染区土壤的。而当向其中加入外源砷后，微污染土壤的微生物数量明显减少；而长期在高浓度砷土壤中的微生物数量却不减反增。

在研究外源砷对未受砷污染土壤中的微生物数量影响的同时，也对受砷污染土壤的样品进行调查。这种调查除了可以反映调查土壤的微生物数量受砷浓度影响而变化外，还可以和未受砷污染土壤的微生物数量的变化作对比。在无砷的有机培养基中，受砷严重污染的土壤中微生物数量比微污染土壤中的要少，这是由于受砷严重污染的土壤中，砷抑制了某些微生物的生长和繁殖，而离污染区２～３ ｋｍ处的茶场土壤受砷污染较少，因此不抗（耐）砷的微生物则能生长。随着外源砷的加入，微污染土壤的微生物数量急剧下降，这是因为茶场土壤的微生物在遇到含砷的培养基，特别是含砷较高的培养基时，出现大量死亡或生长不起来，因此数量大大下降；而含高浓度砷土壤中的微生物数量却不降反升，这是因为受砷严重污染区土壤中本身含有大量的抗（耐）砷菌，砷成为抗砷菌生长所必需的元素，因此微生物的数量大大增加。

３结论

在不同的砷浓度下，砷在３种土壤中对微生物的生长既有促进作用，也有抑制作用；主要表现为土壤中微生物的数量会随着砷浓度的变化而变化。在砷的抑制作用下，随着砷浓度的增加，微生物数量均表现为先减少后增加；不适应砷的微生物首先大量减少或灭绝，而后当土壤中的砷浓度达到某一较高浓度后，能适应环境存活下来的耐砷菌便开始大量繁殖，表现为微生物数量的增加。

外源砷对土壤微生物数量影响的研究只是一项基础工作，后续的工作包括：结合砷对土壤中微生物数量的影响规律，利用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ手段进一步探讨其对微生物种群结构的影响，筛选出具有抗砷、耐砷能力的菌种；分别在不同的外源砷浓度下，研究砷对土壤中的自养、异养型微生物的促进和抑制机制；将微生物、植物修复两者结合起来，在两者的协同作用下，研究砷的降解与吸收特性及两者的协同机制。这些工作还需要进行进一步的深入研究。

参考文献：

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