脑源性神经营养因子与新生儿缺氧缺血性脑病的研究进展
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[中图分类号] R722.1[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（a）-022-03
脑源性神经营养因子(brain derived neuotrophic factor,BDNF)是1982年德国神经生物学家Barde等首次从猪脑中分离纯化出来的一种碱性蛋白质，是神经营养因子（NT）家族中最具代表性的成员之一，对神经系统的多种类型神经元的生长、发育、分化、维护和再生都具有重要作用。近年来有关BDNF的临床应用研究正逐步深入，本文就其与新生儿缺氧缺血性脑病的研究综述如下：
1 BDNF的生物学特性
1.1分子结构与体内分布
1991年Ozcelik等证实人BDNF基因定位于11q13，1989年德国科学家Leibrock等研究表明BDNF基因编码区不存在内含子，属于单一外显子结构。BDNF蛋白分子量13 kDa，等电点（pI）为9.99，主要由两个成熟亚基非共价结合形成的同源二聚体形式存在，平衡超离心研究，即使在蛋白浓度10－10 mol/L也没有发现单体。BDNF蛋白前体含252个氨基酸残基，加工修饰后成为含119个氨基酸残基的成熟亚基。成热BDNF的氨基酸序列高度保守，其3对二硫键位于Cys13～Cys80、Cys58～Cys109、Cys68～Cys111之间，主要由β－折叠和无规则二级结构组成，对BDNF的稳定和功能起重要作用。BDNF成熟区残基序列与NGF比较，肽链长度仅相差1个残基，且超过50％（63个）残基同源，其中包括全部6个半胱氨酸残基和N－乙酰糖基化位点。
BDNF主要由脑组织合成，分布于中枢神经系统的海马、杏仁核和皮质[1]，在海马BDNF mRNA含量较NGF mRNA含量高出20～30倍，也存在于纹状体、基底前脑、丘脑、脑干和小脑。近来发现周围神经系统也有BDNF的合成，卵巢、心、肺、血小板和骨骼肌也有少量表达。
1.2运输方式
传统观点认为NTFs以靶源性方式生成，逆行运输至胞体发挥生物效应。但大量证据表明，神经系统BDNF主要通过旁分泌方式，也可通过自分泌方式与TrkB结合，还存在BDNF的顺行轴突运输过程。Butowt R等[2]利用眼内注射放射性同位素标记的神经营养因子研究表明：视网膜节细胞可顺行运输神经营养因子到中脑上丘，在成年啮齿动物，BDNF的顺行轴突运输过程是由高亲合力受体TrkB介导的。
1.3受体及信号传导
根据神经营养因子受体与NTFs的亲和力的大小，可以分为高亲和力受体和低亲和力受体。
高亲和力受体TrkB，Kd为10－11 mol/L。TrkB是一条单跨膜肽链组成的高度糖基化分子，由821个氨基酸残基组成，分子量为145 kDa，整个分子分成3个结构区：细胞外配体结合区；细胞内酪氨酸蛋白激酶活性区；连接两个区域的跨膜结构。胞外区包括一个由32个氨基酸残基组成的信号肽和富亮氨酸基元（lecuine rich motif，LRM），LRM的侧翼有两个富含胱氦酸簇，后接两个免疫球蛋白样结构域Ig-1和Ig-2，其中一个是结合BDNF所必需的。TrkB是BDNF的功能型受体，是信号转导所必需的。BDNF与TrkB结合使之激活分两步进行，一是配体诱导的受体二聚化，二是胞内区酪氨酸残基的自磷酸化。活化的受体能与多个胞内蛋白质相互作用并使其磷酸化[3]，这些活化的胞内蛋白质进而激活Ras/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径[4]和胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化，使胞内的钙浓度上升，随后激活钙/钙调蛋白依赖性激酶和酪蛋白激酶-2，CREB磷酸化作用[5]，再进一步激活磷脂酰肌醇-3激酶，使信号从胞质传入核内，最后导致基因表达模式的改变包括蛋白质、DNA、RNA等大分子物质的合成，进而引起应答BDNF细胞在生理学和形态学上的改变[6，7]。
低亲和力受体p75NTR，Kd为10－9 mol/L。p75NTR是分子量为75 kDa的跨膜糖蛋自，有一糖基化的胞外部分，包括4个参与配基结合的富胱氨酸簇、跨膜区和一段短的缺乏内在催化活性的胞质序列。其胞外结构区与肿瘤坏死因子受体的结构相同，胞浆结构区具有nmr结构，是死亡信号区。实验证明在无Trk受体存在时，p75NTR有促进细胞凋亡的作用，在Trk受体存在时，p75NTR参与高亲合位点的形成，并增强Trk受体在不同时间、不同组织表达的阶段特异性和组织特异性，在BDNF作用时不是必需的。
1.4生物学功能
BDNF对周围和中枢神经元有广泛的作用，对多种神经元有促进生存、有助分化和再生、增进代谢、增强功能表达及营养、支持、保护的作用。BDNF可以促进神经嵴源和基板源感觉神经元的发育，维持其存话；可支持保护基底前脑乙酰胆碱神经元，中脑纹状体多巴胺神经元的存活和生长，并刺激其分化合成神经元显型需要的蛋白质；维持视网膜神经节，颅神经和运动神经元的生长和存活。BDNF能提高运动和感觉神经元轴突切断术后的存活，并促进神经元修复和再生，还能减少运动神经元的正常死亡[8]。另外，BDNF还可以增强突触间递质的释放，加强突触间信号传导；刺激成年神经元的轴突和树突出芽；调节合成代谢，影响神经元的可塑性。
2 BDNF对新生儿缺氧缺血性脑病保护作用的可能机制
2.1作为内源性保护剂拮抗缺氧缺血性脑损伤
BDNF在中枢神经元中可能通过激活特定的信号传递途径或通过影响转录因子结合DNA的活性来保护神经元免受氧化应激的损害。有实验证实脑缺血后机体提高BDNF mRNA表达的水平是机体保护性机制之一，缺血后产生的大量兴奋性毒性物质最终刺激神经元提高BDNF mRNA表达的水平[9]。在缺血缺氧的状态下，采用trk-Fc融合蛋白阻断BDNF的活性，结果选择性的神经元的存活量明显减少[10]，因此，内源性BDNF可能是抵御缺血缺氧性脑损伤重要的内在保护剂。另外，BDNF和其他多个营养因子有协同作用。研究发现，BDNF对神经元的作用途径有[11，12]：①BDNF可提高神经元表面BDNF受体TrkB的表达水平以利于BDNF对神经元产生生物效应；②BDNF通过活化BDNF受体TrkB，在胞内阻断损伤因子对蛋白激酶C的失活以利于防止神经元发生变性、死亡。
2.2抗细胞内高钙
脑缺血缺氧时，细胞内钙离子的浓度升高，胞内钙离子超载，可通过多种机制引起神经元的死亡。BDNF可使培养的海马神经元内的钙结合蛋白及其mRNA的含量增加，这种钙结合蛋白能排除细胞内超量钙离子，维持细胞内的稳态，从而保护神经元免受脑缺血缺氧的损伤[13]。
2.3抗氧自由基
中枢神经系统氧耗量较高，低水平的抗氧化酶在脑缺血缺氧时易产生大量的自由基和高浓度的过氧化物质，从而损伤神经元。BDNF在体外培养的神经元内可使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的含量明显增加，使自由基减少，以减轻自由基对神经元的损伤[14]。
2.4抗细胞凋亡
缺氧缺血性脑损伤后，凋亡程序的上游物质被激活，从而导致神经元凋亡。BDNF可能通过激活相关信号途径来保护神经元免受损害。有报道显示[15]，BDNF可通过活化细胞外信号调节的蛋白激酶通路，抑制caspase-3的活化，减少新生鼠缺氧缺血动物模型所致神经细胞的凋亡而发挥其神经保护作用。
3 BDNF在缺氧缺血性脑损伤中的应用前景
Schabitz等[16]研究显示，静脉注射BDNF可促进缺血脑内感觉运动神经元的恢复和刺激神经发生。而Galvin等研究发现[17]，持续小剂量脑内给予外源性BDNF能增加新生鼠缺氧缺血性脑损伤后纹状体神经元存活的数量，延长作用时间，无大剂量外源性BDNF引起的不良反应。另有报道，将BDNF加以处理，使其与一些转运蛋白受体抗体结合来辅助进入脑，能提高其透过血脑屏障（BBB）的百分率，并且BDNF的生物活性保存，但是这种方法传递药物的剂量是有限的。借助基因工程手段，将表达BDNF的基因片段通过载体转染导入表达细胞，种植于脑内的相关部位，在局部源源不断地提供营养因子，可免去给药等的诸多不便[18]。通过基因修饰把某些特殊基因嵌入神经细胞的基因，合成具有营养支持作用的物质，促进神经元的再生。皮下或腹腔内注射BDNF、利用生物可吸收材料（纤维连接蛋白等）把BDNF引入神经受损处、应用药物上调内源性BDNF而保护缺氧缺血后受损伤的神经细胞亦越来越引人注目，如静脉注射人类造血干细胞体内BDNF表达明显增加[19]。胡圣望等[20]通过电针刺“百合”“大椎”两穴可显著增加新生大鼠缺氧缺血后皮质和海马CA2及CA3区的BDNF表达，提示电针干预治疗不可忽视。
4 问题与展望
BDNF对新生儿缺氧缺血所致的脑损伤具有治疗潜能，但BDNF来源困难、半衰期短、组织含量低、不能通过血脑屏障（BBB），临床应用前存在着给药途径、药物安全性、药物时效关系及时量关系等问题，特别是给药途径方面，常规途径应用疗效较差，临床上缺乏一条合理有效的给药途径。然而，随着分子生物学技术和基因工程手段研究的深入，相信在不远的将来BDNF必将会应用到新生儿缺氧缺血性脑病的治疗。
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（收稿日期：2008-03-26）