尾悬吊模拟失重对大鼠肺组织细胞凋亡的影响及其干预
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摘要： ［目的］ 研究尾悬吊模拟失重大鼠肺组织细胞凋亡情况的变化及其防护方法。 ［ 方法 ］ 采用尾悬吊模拟失重，分为悬吊7 d、21 d组和相应对照组以及悬吊7 d地塞米松干预组，每组10只健康雄性SD大鼠，共50只。采用原位细胞凋亡检测技术检测肺组织的细胞凋亡情况，采用原位杂交技术检测肺组织BCL-2和BAX的表达情况。 ［ 结果 ］ 大鼠肺组织普遍存在凋亡细胞，7 d尾悬吊模拟失重大鼠肺组织细胞凋亡水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05）；21 d组的差异无显著性（P > 0.05）。7 d尾悬吊模拟失重大鼠肺组织BCL-2 mRNA水平明显低于对照组，BAX mRNA水平明显高于对照组，差异均具有统计学意义（P < 0.05）；21 d组的差异均无显著性（P > 0.05）。地塞米松干预后细胞凋亡水平明显低于尾悬吊组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 ［ 结论 ］ 尾悬吊7 d模拟失重大鼠肺组织存在细胞凋亡过度，凋亡调控基因也有相应变化；地塞米松可用于抑制模拟失重时肺组织的细胞过度凋亡。
关键词：失重模拟；悬吊；凋亡；基因；肺组织；地塞米松
Study of the Effect and Its Protection of Simulated Weightlessness on Cell Apoptosis in Pulmonary Tissues of Tail-suspended RatsWANG Jun-feng，LIU Chang-ting，HAO Cong-jun，WANG De-long（General Hospital of PLA，Beijing 100853，China）
Abstract：［Objective］ To investigate the changes and its protection of cell apoptosis in pulmonary tissues of tail-suspended rats in simulated weightlessness condition. ［ Methods ］ Experiments were conducted on 50 Spragno-Dawley male rats. The rats were divided into 5 groups：i.e. tail-suspended for 7 days group with its control group，tail-suspended for 21 days with its control group，and dexamethasone treatment at the 3rd day of tail-suspension group. Tail-suspension（-30°）was used as weightlessness simulation. The condition of cell apoptosis in pulmonary tissues was detected with in situ death detection，and the condition of BCL-2 and BAX mRNA in pulmonary tissues was detected by hybridization in situ. ［ Results ］ There were apoptotic cells in pulmonary tissues of rats in general. The level of cell apoptosis in pulmonary tissues of 7 d tail-suspended rats increased significantly（P < 0.05），but that of 21 d group did not show a prominent change（P > 0.05）. The level of BCL-2 mRNA and of BAX mRNA in pulmonary tissues of 7 d tail-suspended rats decreased and increased respectively with statistical significance（P < 0.05），but both those indices of 21 d group did not show a prominent change（P > 0.05）. The level of cell apoptosis in pulmonary tissues after dexamethasone treatment decreased significantly than that in tail-suspension group（P < 0.05）. ［ Conclusion ］ There were excessive apoptotic cells in pulmonary tissues of 7 d tail-suspended rats in simulated weightlessness condition and BCL-2 and BAX mRNA showed corresponding changes. Dexamethasone can be used to inhibit pulmonary tissues apoptosis in simulated weightlessness condition.
Key Words：simulated weightlessness；suspension；apoptosis；gene；pulmonary tissues；dexamethasone
细胞凋亡是一种高度调控的细胞程序性死亡方式，同细胞分化、增殖和迁移一样维持着生物体的自身稳定。近年来对细胞凋亡及其调控基因研究较多，以了解许多疾病的发病机制和提供新的治疗手段［1］。失重或模拟失重时存在一定程度肺损伤已被证实［2，3］，探讨肺组织的细胞凋亡变化必然有助于了解失重或模拟失重时肺损伤的发生机制，有助于寻求有效的防护措施。本研究采用大鼠尾部悬吊法来模拟失重状态，对肺组织进行原位细胞凋亡检测，并应用地塞米松进行药物干预。
1 材料和方法
1.1 动物饲养与模型建立［3，4］
选择健康雄性Sprague-Dawley大鼠（本医院动物中心提供）50只，体重170～200 g，按体重相近配对的原则，分为尾部悬吊7 d组、7 d同步对照组、尾部悬吊21 d组、21 d同步对照组和尾部悬吊7 d地塞米松干预组，共5组，每组10只大鼠。采用尾悬吊-30°作为模拟失重模型，每只吊笼内悬吊一只大鼠，尾部悬于笼顶，使鼠前肢踏于笼底的玻璃棒上，后肢悬空，身体纵轴与水平面成30°夹角。对照组动物也置于同样鼠笼中，尾部不悬吊，可自由活动。地塞米松干预组于尾悬吊第3天开始腹腔注射地塞米松5 mg/kg，每日1次，共5 d。实验过程中所有大鼠可自由进食、饮水。
1.2 肺组织病理学检查
悬吊组、对照组和地塞米松干预组分别于7 d、21 d悬吊结束时用10%水合氯醛30 ml/kg将大鼠腹腔注射麻醉后，打开胸腔取出肺组织，用10%甲醛磷酸缓冲液固定，按常规脱水、石蜡包埋，用切片机切成3 μm厚的切片贴在载玻片上，做HE染色，用光学显微镜观察细胞凋亡情况。
1.3 肺组织原位细胞凋亡检测
切片常规脱蜡至水；用3% H2O2封闭10 min，蒸馏水洗涤3×2 min；加TBS 1 : 100稀释的Proteinase K 37 ℃消化15 min，TBS洗涤3×2 min；加TdT和DIG-d-UTP各1 ml，37 ℃标记2 h，TBS洗涤3×2 min；加封闭液50 μl室温30 min后，用封闭液1 : 100稀释的生物素化抗地高辛抗体50 μl 37 ℃反应30 min，TBS洗涤3×2 min；用TBS 1 : 100稀释的SABC 1 m1 37 ℃反应10 min，TBS洗涤4×5 min；DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，用显微镜观察细胞凋亡情况［5］。凋亡阳性细胞的细胞核中有棕黄色颗粒，由于后期DN段可透过核膜扩散至胞质，故胞质亦可呈阳性。计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数，以凋亡指数（凋亡细胞/100个细胞）表示。按凋亡细胞占细胞总数的百分率将凋亡分为五级：≤2%为0级；3%～9%为1级；10%～19%为2级；20%～39%为3级；≥40%为4级。
1.4 肺组织原位杂交染色检测BCL-2 mRNA和BAX mRNA的表达
悬吊组和对照组分别于7 d、21 d悬吊结束时用10%水合氯醛30 ml/kg将大鼠腹腔注射麻醉后，打开胸腔取出肺组织，液氮冰冻后切成20 μm厚的切片，4%多聚甲醛室温固定30 min进行原位杂交染色，其具体步骤为：①0.5% H2O2（甲醛）灭活内源性过氧化物，室温处理30 min；②暴露mRNA核酸片段，滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化37℃ 2 min；③滴加20 μl预杂交液37 ℃杂交3 h；④滴加20 μl杂交液37 ℃杂交过夜；⑤滴加封闭液37 ℃ 30 min；⑥滴加生物素化鼠抗地高辛37 ℃60 min；⑦滴加SABC 37 ℃ 20 min；⑧滴加生物素化过氧化物酶37 ℃ 20 min；⑨DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片观察［6］。阳性细胞胞质内有棕黄色颗粒，根据染色的强弱分为5级：0级为不染色即阴性；1级为局部染色阳性，小于总细胞数的25%；2级为广泛弱染色；3级为广泛中度染色；4级为广泛强染色。
1.5 统计学处理
分别用χ2检验和t检验比较两组间差异，统计学软件为Stata。
2 结果
2.1 肺脏病理改变
7 d和21 d尾悬吊组大鼠都出现肉眼可见的肺脏表面点片状出血，出血部位多位于右肺前叶，背侧重于腹侧；正常对照组中仅1只出现轻度点状出血。尾悬吊组光镜下可见小静脉及毛细血管充盈扩张，肺泡内红细胞、单个核细胞明显增多，肺泡间隔增厚，肺泡腔受压变形。
2.2 肺组织细胞凋亡情况
7 d悬吊组大鼠肺组织细胞凋亡水平明显高于对照组（P < 0.05），染色阳性细胞范围非常广泛，包括支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和间质细胞等；21 d尾悬吊组大鼠肺组织细胞凋亡水平同7 d相比有所减弱，与对照组差异无统计学意义（P > 0.05），见表1及图1-a，b，c。
2.3 肺组织细胞BCL-2 mRNA和BAX mRNA的变化
7 d悬吊组大鼠肺组织细胞BCL-2 mRNA表达水平明显低于对照组（P < 0.05），染色阳性细胞范围非常广泛，包括支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和间质细胞等；21 d尾悬吊组大鼠肺组织细胞BCL-2 mRNA表达水平与对照组相比无明显变化（P > 0.05）（见表1及图1-d，e，f）。7 d悬吊组大鼠肺组织细胞BAX mRNA表达水平明显高于对照组（P < 0.05），染色阳性细胞范围亦非常广泛，包括支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和间质细胞等；21 d尾悬吊组大鼠肺组织细胞BAX mRNA表达水平与对照组相比无明显变化（P > 0.05），见表1及图1-g，h，i。
2.4 地塞米松干预后尾悬吊大鼠肺组织细胞凋亡的变化
尾悬吊7 d组大鼠肺组织细胞凋亡指数为（22.3±2.7）%，明显高于对照组（2.0±1.0）%（P < 0.05）；地塞米松干预组大鼠肺组织细胞凋亡指数为（10.5±1.8）%，显著低于尾悬吊组（P < 0.05），见表2。
3 讨论
细胞凋亡是机体维持细胞群体数量稳态的重要手段，细胞凋亡失调包括凋亡不足和凋亡过度，可成为某些疾病的重要发病机制。无论凋亡不足还是凋亡过度，都会影响器官正常功能，而如果证实了某些病理过程中凋亡失调的存在，调控凋亡过程则是人类防治这些疾病的新途径［7，8］。关于失重对肺组织细胞凋亡的影响，国内外已有一些报道，本研究就是要着重探讨其基因调控机制和寻求有效的防护措施。
本研究结果表明模拟失重条件下肺组织存在细胞凋亡过度，凋亡细胞范围非常广泛，包括支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺泡上皮和间质细胞等。但凋亡过度主要表现在模拟失重早期（7 d）， 后期（21 d组）细胞凋亡水平基本恢复正常，说明随着模拟失重时间的延长，机体各方面功能逐渐适应了模拟失重所造成的损害，通过机体内部各种调节因素，极力减少组织损伤和恢复器官正常功能。模拟失重条件下肺组织细胞凋亡过度的原因可能与肺循环灌注血量大量增加有关。沈羡云［9］等用脉图方法观察到头低位-15°倾斜模拟失重期间肺循环在60 min内明显增多。仲崇发［10］等曾观察模拟失重条件下心肺循环变化的特点，发现肺循环阻力增高，并认为阻力的增加是肺动脉压增高的直接原因，而这与体液向头胸部转移，大量血液潴留在肺血管内直接相关。国外PRISK［11］等也测量了在太空飞行9 d的4名宇航员的肺毛细血管血流量（Vc ），发现Vc增长了28%。所以肺循环灌注血量大量增加是始发因素，然后它启动了细胞凋亡的诱导因素。沈羡云［12］等观察了头低位-20°限制活动期间兔生理指标的变化，肉眼即可见兔肺发生程度不同的肺气肿，有的有实变，镜下出现明显肺不张、肺水肿和肺气肿，同时有明显的充血、溶血和出血现象。王承珉［3］等也观察了尾悬吊模拟失重对大鼠肺脏的影响，结果和兔肺基本相似，而且悬吊5.5 d和6.5 d组形态学变化相似。本研究也观察到了相似的变化。可见，模拟失重条件下肺组织细胞凋亡过度可能是在细胞层面对以上种种肺损伤的一种表现。
已发现有多种因子能诱导或抑制细胞凋亡，而BCL-2基因家族是最重要的，它通过BCL-2和BAX的比率来调节细胞凋亡。人BCL-2基因是从与滤泡性淋巴瘤相关的t（14：18）染色体异位的断裂点部位克隆到的，其蛋白抑制由各种不同的信号诱导的凋亡，并且对正常生长发育及肿瘤都有重要作用［13］。人BAX基因位于染色体19q13.4，含有6个外显子，其蛋白首次发现是通过BCL-2的免疫沉淀鉴定到的，可与BCL-2蛋白形成异二聚体复合物，抑制BCL-2的功能，可以促进细胞凋亡［8］。本研究通过原位杂交技术可见模拟失重7 d时大鼠肺组织BAX mRNA表达增多，相反BCL-2 mRNA表达却减少，而到模拟失重21 d时无论BAX mRNA还是BCL-2 mRNA都没有明显变化，这与我们通过原位细胞凋亡检测观察到的只在模拟失重7d 时细胞凋亡过度的结果是一致的，说明BCL-2基因和BAX基因在失重或模拟失重时肺组织细胞凋亡调控中发挥着重要的作用。
糖皮质激素有很强的抗炎作用，可减轻急性肺损伤时的渗出、水肿、毛细血管扩张和粒细胞浸润等。糖皮质激素的作用机制在于其与靶细胞胞浆内的糖皮质激素受体结合后影响参与炎症的一些基因转录而产生抗炎作用。近年来的研究表明，它还能有效地抑制细胞凋亡。WEN等［14］的研究显示，地塞米松可抑制IFN-γ诱导的肺泡上皮细胞凋亡。等［15］采用内毒素复制大鼠肺损伤模型，结果显示地塞米松可抑制IFN-γ释放，还可抑制FAS或FASL基因的表达，起到调控肺组织靶细胞凋亡的作用。本研究结果显示，地塞米松干预组肺组织细胞凋亡指数显著低于尾悬吊组，表明地塞米松可抑制模拟失重引起的肺组织细胞凋亡，其重要机制可能就是通过调节凋亡调控基因BCL-2 mRNA和BAX mRNA的表达来实现的。
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（收稿日期：2006-08-25）
“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”。