土鳖虫多肽溶液抗肿瘤作用研究

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【摘要】 目的：研究土鳖虫多肽溶液抗肿瘤作用。方法：以H22肿瘤小鼠为动物模型，给药10天后处死，取肿瘤、脾脏、胸腺并称重，计算抑瘤率、脾脏系数和胸腺系数；取肝脏检测MDA水平和SOD活性。结果：土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠的抑瘤率为46.79%，脾脏系数和胸腺系数均较模型对照组升高（P

【关键词】 土鳖虫；多肽；抗肿瘤

anti-tumor effect of Eupolyphage sinensis Walker polypeptide solution

Li XingnuanYu HuanQin Zhongjun

(College of Medical, Jiujiang University, Jiujiang, 332000)

【Abstract】Abjective To study the anti-tumor effect of Eupolyphage sinensis Walker polypeptide solution. Methods The tumor model in mice was established by line of H22 liver cancer. After 10 days of treatment, the mice were killed, the subcutaneous sarcoma, spleen and thymus were separated and weight; The MDA level and SOD activity of liver were tested. Results The inhibition rate of Eupolyphage sinensis Walker polypeptide solution on H22-Hepatoma bearing mice was 46.79%；The spleen index and thymus index were higher than model control group(P

【Key words】Eupolyphage sinensis Walker；polypeptide；anti-tumor

土鳖虫（Eupolyphage sinensis Walker ）, 又名土元，属节肢动物门昆虫纲蜚蠊目鳖蠊科昆虫，为《中华人民共和国药典》记载的正品药材，是传统的活血化瘀类动物药。祖国医学记载和丰富的临床实践均已证明其具有破血逐瘀、续筋接骨、消炎散结和舒经活血等重要药用功效[1]。现代药理试验也充分证明地鳖虫具有溶解静脉血栓，抑制血小板聚集，抗凝血和抗癌等药效[2]。

作者前期研究证实土鳖虫蛋白粗提液及纤溶活性蛋白组分具有明显的抑瘤作用[3]。本文研究土鳖虫酶解多肽对肿瘤生长的抑制作用，及对肿瘤小鼠肝脏抗氧化作用进行研究，以期为土鳖虫在抗肿瘤作用方面的应用提供更多的理论依据。

1材料与方法

1.1试验药物

土鳖虫木瓜蛋白酶酶解液（自制）。环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司）。

1.2试剂

木瓜蛋白酶（Sigma公司），丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3动物

昆明小鼠，雄性，体重21~25 g，清洁级，由汕头大学医学院动物中心提供；H22瘤株（本实验室保存）。

1.4仪器

水浴锅（常州国华仪器有限公司），离心机（Eppendorf公司），酶标仪（Thermo公司）。

1.5方法

1.5.1土鳖虫多肽溶液及土鳖虫水提液的制备

取新鲜冻存的土鳖虫，自来水洗净，再用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4）冲洗后，按质量体积1：2加入0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4），用高速组织捣碎机匀浆，9000rpm离心15min取上清，在最佳酶解条件下用木瓜蛋白酶酶解（另文发表）土鳖虫匀浆上清液，酶解结束后9500rpm离心15min取上清，即得土鳖虫多肽溶液。上述土鳖虫匀浆上清液，即为土鳖虫水提液。

1.5.2土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠的抑瘤作用

无菌条件下取腹腔接种H22肿瘤小鼠的腹水，用生理盐水调节肿瘤细胞浓度为1×107个/ml，按0.2ml每只老鼠的剂量接种于昆明小鼠右腋皮下，接种次日将接种肿瘤的小鼠随机分为：模型对照组、土鳖虫多肽组、土鳖虫水提液组和环磷酰胺组，每组10只，另取10只未接种肿瘤的小鼠作为空白对照组。模型对照组每日灌胃给予0.1ml/10g生理盐水，土鳖虫多肽组每日灌胃给予20g/kg（以生药量计算）的土鳖虫多肽溶液，土鳖虫水提液组每日灌胃给予20g/kg（以生药量计算）的土鳖虫水提液，环磷酰胺组每两日腹腔注射20mg/kg环磷酰胺。共给药10天，于末次给药24h后脱颈椎处死。取瘤块、脾脏、胸腺并称重，计算并比较各组抑瘤率和器官系数。抑瘤率/%=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%，器官系数=器官重量/动物体重（g/kg）。

1.5.3土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠肝脏MDA水平和SOD活性的影响取小鼠肝脏匀浆后离心取上清，根据说明书操作步骤检测MDA水平和SOD活性。

2结果

2.1土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤的抑瘤作用

由表1可以看出，土鳖虫多肽组和土鳖虫水提液组抑瘤率分别为46.79%和32.15%，平均瘤重均小于模型对照组，差异有显著性，且土鳖虫多肽组与水提液组比较也有差异。

关于脾脏系数和胸腺系数，土鳖虫多肽组与模型对照组比较有差异，均有升高；土鳖虫水提液组差异不显著；环磷酰胺组与模型对照组比较有差异，均降低。

2.2土鳖虫多肽溶液对H22肿瘤小鼠肝脏MDA水平和SOD活性的影响

由表2可以看出，各组肿瘤小鼠肝脏MDA水平均较空白对照组高，而SOD活性则均较空白对照组低，说明H22肿瘤对小鼠肝脏有一定程度的损伤。土鳖虫多肽组小鼠肝脏MDA水平较模型对照组低，SOD活性较模型对照组高，说明土鳖虫多肽能使小鼠肝脏抗氧化活性得到恢复，缓解自由基对肝脏的氧化损伤。

3讨论

本实验采用筛选药物常用的H22动物移植瘤模型给药10天，结果显示土鳖虫酶解多肽对H22肿瘤抑制效果明显。

蛋白质不完全水解后产生的一些肽段可能具有比其前体更强的生物活性。本实验中，土鳖虫匀浆上清液即水提液酶解后获得的多肽溶解较未酶解的抑瘤效果明显，说明土鳖虫水提液中某些蛋白质经蛋白酶水解后，抗肿瘤效果更明显；并且对增加肿瘤小鼠免疫器官重量和增强肝脏抗氧化能力方面均有明显提高。

机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展有密切关系，肿瘤细胞的增殖通常伴有免疫应答的减弱[4]，有利于肿瘤细胞逃脱免疫监视，同时也降低机体对其它病理侵害的抵抗力。本实验中，肿瘤小鼠的脾脏系数和胸腺系数均比空白对照组低，说明免疫能力有不同程度的减弱。应用环磷酰胺抑制肿瘤生长的同时，对肿瘤小鼠的免疫系统系统有较大影响，而土鳖虫多肽抑制肿瘤作用的同时，对肿瘤小鼠的免疫器官影响较小，说明生物来源的抗肿瘤药物较化疗药物毒副作用小，应用前景更广阔。

有关研究表明，自由基的产生和消除失衡与肿瘤的发生发展有密切关系。有的学者认为氧自由基既可直接损伤DNA，也可通过脂类过氧化间接损伤DNA，最终引起癌变。本实验中观察到肿瘤小鼠肝脏SOD活性低于正常对照组，而MDA含量高于正常对照组。我们认为这是由于癌变造成血液循环障碍，细胞缺血缺氧，通过黄嘌呤氧化酶途径导致氧自由基增多而SOD等清除自由基的酶合成减少，自由基的产生与消除处于失衡状态，导致脂质过氧化作用增强，产生的自由基直接或间接地损伤DNA，引起癌变。给予荷瘤小鼠土鳖虫多肽溶液后SOD活性提高的同时，MDA的生成得到抑制，MDA含量下降。说明土鳖虫多肽具有一定的抗氧化作用。由于实验中应用的是多肽混合液，具体起作用的多肽组分还需进一步分离纯化后确定。

参考文献

[1]杨耀芳, 杨翊雯, 王赛前, 封美佳. 土鳖虫口服液镇痛、活血化淤与红细胞免疫研究.中成药,2003,25(6): 496~499.

[2]卢颖, 江佩芬. 土鳖虫化学成分的研究.中国中药杂志, 1992,17(2):487~489.

[3]韩雅莉, 郭桅, 李兴暖, 谭竹钧. 地鳖纤溶活性蛋白对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用. 中国药理学通报, 2009；25(7): 900~903.

[4]Choi SH, Chung EJ ,Whang DY, et al. Alteration of signal-transducing molecules in tumor-infiltrating lymphocytes and peripheral blood T lymphocytes from human colorectal carcinoma patients. Cancer Immunol Immunother, 1998； 45(6): 299~305.

作者简介：李兴暖（1976～），女，山东日照人。讲师，博士，主要从事中药抗肿瘤作用研究。