国产注射用特立帕肽的过敏性及免疫原性研究

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[摘要] 目的 考察国产注射用特立帕肽在动物中的过敏性及免疫原性。 方法 对豚鼠和家兔分别于0 d和14 d注射一定浓度的特立帕肽，观察豚鼠全身变态反应及对家兔的免疫原性，并采用ELISA分析家兔血清抗体的变化规律。 结果 给药后豚鼠未见明显全身变态反应。家兔免疫原性实验结果表明，低剂量组（1 μg/kg）血清中的IgE含量经免疫后无明显上升；中剂量组（5 μg/kg）和高剂量组（10 μg/kg）血清中IgE含量在首次免疫后略有快速上升，但随后中剂量组恢复正常，而高剂量组在加强免疫后IgE含量仍有一定上升。 结论 国产注射用特立帕肽在拟定的人用剂量范围内具有很好的安全性，可供皮下注射给药。

[关键词] 注射用特立帕肽；皮下注射；过敏性；免疫原性

[中图分类号] R392.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（b）-0007-03

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织退化为特征的最常见的代谢性骨病。市场上多数治疗骨质疏松症的药物，如雌激素、双磷酸盐类和降血钙素均属骨吸收抑制剂。而其他一些药物，如氟化物、甲状旁腺激素（PTH）是骨形成促进剂[1]。

特立帕肽（teriparatide）商品名为Forteo，由礼来公司研制开发，2002年12月在美国首次上市，随后相继在奥地利、丹麦、芬兰、德国、希腊、冰岛、爱尔兰、荷兰、挪威、葡萄牙、瑞士、英国、澳大利亚等国上市[2-3]。本品于2011年进口到我国市场，适用于患骨质疏松症、有高度骨折危险的绝经期妇女[4]，亦适用于有高度骨折危险的原发性或性腺功能减退性骨质疏松症男性患者，包括有骨质疏松性骨折史、有骨折多种危险因素或经评价对先前疗法无效或不耐受的骨质疏松症患者[5]。本品原研产品为重组人甲状旁腺激素（rhPTH）1-34，与内源性PTH类似，可与特异性高亲和性细胞表面受体结合发挥生物学作用[6]。动物实验表明，本品1次/d给药对成骨细胞的刺激作用高于其对破骨细胞的作用，可引起小梁骨和皮质骨表面的新骨生成[7]。此外，可改善小梁骨微结构，并通过刺激松质骨和皮质骨中的新骨生成，增加骨量，提高骨强度。临床研究提示，本品的促合成效应表现为增加骨量、骨形成和再吸收，从而提高骨强度。与安慰剂组病例相比，使用特立帕肽治疗1～2年可使脊骨骨折危险性下降65%，非外伤性非脊骨骨折危险性下降53%[8]。

海南双成药业有限公司在进口Forteo的基础上，采用固相合成法成功合成了含34肽的特立帕肽，并采用冻干工艺制备了注射用特立帕肽。因其主药为大分子活性物质，可能激活机体自身的免疫反应[9]，特采用豚鼠全身过敏性试验及家兔免疫原性试验检测其过敏性和免疫原性，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

注射用特立帕肽，海南双成药业有限公司提供，批号20100601，规格：20 μg；牛血清白蛋白，中国医药集团上海化学试剂公司生产，批号970612；注射用生理盐水，石家庄四药有限公司，批号100425807；Rabbit IgE ELISA试剂盒，美国RapidBio Lab产品。

1.2 试验动物

豚鼠24只，雌雄各半，平均体重（300±35） g，由浙江省实验动物中心提供。按照普通级别饲养管理，自由饮用消毒自来水，饲料为标准颗粒饲料，黑白光照各12 h，自由活动。

新西兰家兔，体重2.0～2.5 kg，由浙江省实验动物中心提供。按照清洁级别饲养管理，自由饮用消毒自来水，饲料为标准颗粒饲料，黑白光照各12 h，自由活动。

1.3 试验方法

1.3.1 豚鼠全身过敏性试验[10]

1.3.1.1 实验动物分组及给药剂量 将豚鼠随机分为4组，每组6只，雌雄各半。分别为葡萄糖注射液阴性组、牛血清白蛋白阳性组、特立帕肽低剂量组（1.587 μg/ml）和高剂量组（4.761 μg/kg）。给药途径均为肌内注射，给药体积阴性组和阳性组分别为0.5 ml/只；特立帕肽高低剂量组均为1 ml/kg。

1.3.1.2 溶液配制 根据特立帕肽人用临床单次剂量（20 μg/60 kg）折算得豚鼠的单次给药剂量为1.587 μg/kg，所以受试药物特立帕肽注射剂的低、高剂量组（低剂量的3倍）的单次给药剂量分别为1.587 μg/kg和4.761 μg/kg。

①特立帕肽注射剂低剂量组：20 μg注射剂溶解于12.6 ml生理盐水中，得1.587 μg/ml；②特立帕肽注射剂高剂量组：20 μg注射剂溶解于4.2 ml生理盐水中，得4.761 μg/kg；③牛血清白蛋白阳性组：50 mg牛血清白蛋白溶解于5 ml生理盐水中，得终浓度10 mg/ml溶液；④葡萄糖注射液阴性组：注射用葡萄糖溶液。

1.3.1.3 豚鼠过敏性检测方法及评价标准 每个实验组的6只豚鼠隔天肌内注射供试品，连续3 d刺激。然后将豚鼠分成两组，特立帕肽低剂量组于注射后的第14天腹腔注射供试品，给药量是首次注射的4倍，观察注射后有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克、死亡等过敏症状反应。特立帕肽高剂量组于首次注射后的第21天腹腔注射供试品，给药剂量是首次注射的4倍，并进行观察。评价标准详见表1。

1.3.2 家兔免疫原性试验

1.3.2.1 溶液配制 特立帕肽注射剂：20 μg注射剂溶解于生理盐水，分别配制成20、10、2 μg/ml不同浓度。

1.3.2.2 实验分组及给药剂量 根据特立帕肽人用临床单次剂量（20 μg/60 kg）折算得家兔的单次给药剂量为1.06 μg/kg，现设计剂量组为1、5、10 μg/kg进行家兔免疫原性试验，给药方式为皮下注射。

1.3.2.3 免疫原性检测 ①不同受试药物剂量分别经皮下注射免疫家兔，每只家兔在14 d后加强免疫一次。并分别于实验前1 d（D0）、初免当天（D1）、加强免疫当天（D14）和加强免疫后（D28）进行家兔耳缘静脉采血1 ml，分离血清，-30℃冻存备用。②采用ELISA检测血清中IgE含量。

包被过的96孔板每孔加入100 μl样本（待测血清样本、标准品），混匀后在37℃孵箱中温育90 min；每孔加入350 μl洗液清洗，重复5遍；每孔加入100 μl Biotin，混匀后在37℃孵箱中温育60 min；每孔加入350 μl洗液清洗，重复5遍；每孔加入100 μl HRP，混匀后在37℃孵箱中温育30 min；每孔加入350 μl洗液清洗，重复5遍；每孔加入100 μl显色液，混匀后在37℃孵箱中避光温育20 min；每孔加入100 μl终止液，混匀30 s，立刻用多功能检测仪读取OD值（吸收波长450 nm）。

2 结果

2.1豚鼠过敏性试验的评价结果

葡萄糖注射液阴性组豚鼠注射葡萄糖注射液攻击后，基本没有出现过敏症状，有1只有轻微的搔鼻现象。牛血清白蛋白阳性组豚鼠注射牛血清白蛋白攻击后，有1只死亡，3只出现鼻子严重的脱毛现象以及眼角有分泌物，1只出现搔鼻反应。特立帕肽低剂量组6只豚鼠在接受攻击性注射后均表现正常，没有出现过敏性症状。特立帕肽高剂量组1只豚鼠在接受第2次攻击后死亡，1只在首次肌注后死亡，其余4只均正常。结果表明，受试药物特立帕肽注射剂在临床推荐使用浓度范围内其致变态反应表现为阴性（表2）。

2.2 家兔免疫原性的检测结果

将分别于D0、D1、D14和D28采取的家兔血清样本进行IgE含量检测。ELISA检测结果显示，低剂量组（1 μg/kg）血清中的IgE含量很低，经过免疫后也没有明显上升。而中剂量组（5 μg/kg）和高剂量组（10 μg/kg）血清中IgE含量在首次免疫后略有快速上升，但随后中剂量组恢复正常，而高剂量组在加强免疫后IgE含量仍有上升（图1、2）。

3 讨论

多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。国产注射用特立帕肽是由34个氨基酸经固相合成制成的甲状旁腺激素激动剂，因其主药为大分子活性物质，可能激活机体自身的免疫反应，不可避免地会激活机体自身的免疫反应，比如形成针对药物的抗体、激活T细胞或内源性免疫反应等，从而降低药物疗效，带来临床安全用药方面的担忧[11]。

豚鼠全身过敏性试验是常用的药物过敏性检测手段[12]。本研究根据特立帕肽人用临床单次剂量设定受试药物特立帕肽注射剂的低、高剂量组进行豚鼠注射给药，结果表明本品在临床推荐使用浓度范围内致豚鼠变态反应表现为阴性。常用的免疫原性检测方法有放射性免疫测定、ELISA、间接血凝试验和间接血凝抑制试验测定等。其中ELISA有灵敏性高、特异性强、检测迅速和成本低廉等特点。本试验ELISA检测结果显示，低剂量组特立帕肽（1 μg/kg）血清中的IgE含量很低，经过免疫后也没有明显上升，提示无明显免疫原性。而中剂量组（5 μg/kg）和高剂量组（10 μg/kg）血清中IgE含量在首次免疫后略有快速上升，但随后中剂量组恢复正常。以上动物试验提示国产注射用特立帕肽在拟定的人用剂量范围内无明显过敏性和免疫原性，可供皮下注射给药。

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[12] 国家食品药品监督管理局.化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[Z].北京：国家食品药品监督管理局，2005.

（收稿日期：2013-05-08 本文编辑：林利利）