羊骨髓间充质干细胞的体外培养及临床鉴定分析
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摘 要 目的：探讨体外培养的羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）、一般细胞的生物学特性。方法：应用免疫组化学方法，对培养的骨髓基质的间充质干细胞（MSCs）进行细胞生长测定。结果：培养的MSCs粘附贴壁、呈纺锤状，并有多个突起；传代培养MSCs的潜伏期为24小时，对数增殖期3～6天，接种后第8天MSCs生长逐渐缓慢，进入平台期；免疫细胞化学染色后显示所培养细胞的细胞膜抗原CD44阳性。结论：培养的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征。
资料与方法
采用健康中国山羊，月龄10个月。主要试剂为水合氯醛、安定、肝素、粉剂DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、淋巴分离液、多聚甲醛（PFA）、小鼠抗山羊CD44、免疫组化学试剂盒等。 其主要仪器包括细胞培养瓶、24孔细胞培养板、1ml冻存管、超净工作台、离心机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、振荡器等。
实验方法：①羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）［1~3］的分离和培养。把10个月龄的山羊，用水合氯醛和安定各1ml肌肉注射麻醉，固定四肢，术区剃毛，常规消毒铺巾。于髂后上棘处骨髓腔穿刺，抽取骨髓5ml，与等量的DMEM培养液充分混匀。将骨髓1000转/分离心5分钟，弃含油脂的上清，加入DMEM液吹匀至15ml，见离心管分为清晰的5层，即脂肪层、血小板DMEM培养液层、单核细胞层、淋巴细胞分离液、红细胞和巨噬细胞层。吸取中间含有BMSCs的单核细胞层有核细胞层，再加入DMEM 5ml吹打漂洗，1500转/分离心5分钟，去上清，重复3次，在沉淀中加入原代培养液10ml，反复吹打制成单细胞悬液，接种到50ml培养瓶，置37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱内孵育，3 天后首次全量换液，以后每3～4天换液1次，倒置显微镜下观察细胞变化。待85%左右的瓶底细胞融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，洗涤后再以5×104个/ml的密度接种，称为第一继代（P1），待细胞再次长至90%汇合时，同法传代，称为P2、P3等。②羊BMSCs的生长曲线测定。选择好P3、P5、P7细胞悬液，接种于24孔培养板，每孔1ml，每天各取3孔消化贴壁细胞并计数，计算均值连续8天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞传代后生长曲线。③羊BMSCs的免疫组化学鉴定。取P3代的羊BMSCs的细胞悬液接种到加有盖玻片经多聚赖氨酸涂片的24孔板，当盖玻片上的细胞密度达 1×105 /ml时，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定过夜，PBS振洗，3%双氧水灭活内源性活性酶，滴加正常兔血清，室温封闭20分钟；滴加一抗工作液（小鼠抗山羊CD44），4℃过夜，PBS振洗；用 DAB室温显色25分钟，脱水、透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察记录。④羊BMSCs的冻存。取P3代对数生长期的羊BMSCs细胞（冻存前全量换液），用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集，加入等量的冻存液，吹打均匀，以1ml/支移入无菌冻存管密封。-20℃2小时后，移至-80℃深低温冰箱中冻存8～10个小时，然后移入-196℃的液氮中。 ⑤冻存羊BMSCs的复苏。取出冻存管后，迅速投入加有37℃温水的烧杯中移入超净操作台，然后将融化的细胞悬液移入离心管，加入完全培养液10～15ml，吹打均匀，加入完全培养基以1×105个/ml接种于50ml培养瓶中，24小时后全量换液1次，以后常规培养。
结 果
羊BMSCs的形态学特征：原代细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形，胞体透亮，折光性好，细胞核呈卵圆形，有较多的骨髓造血系细胞混杂。3天后换液可去掉大部分悬浮细胞，9天换液后悬浮细胞基本去除，瓶底聚集生长的细胞形态多不规则，15天可见多处聚集生长的细胞群脱落，中心细胞为梭形，可见2～3个突起。根据生长情况每4～7天进行1次传代，传代细胞接种后2～4小时即迅速贴壁、伸展，6～10小时活细胞基本完成贴壁；2～5天细胞呈梭形或不规则的三角形，也有扁平形带突起的细胞，胞内可见2～4个核均匀分布。传代细胞的生长较原代较快，接种后7天即可铺满整个培养瓶底。 冻存复苏的活细胞率为95.6%，细胞贴壁较传代细胞稍慢，24小时后仍有部分细胞未贴壁，8天即可铺满培养瓶底。
羊BMSCs的生长曲线测定：三代细胞生长周期基本一致，接种培养后前2～3天，生长较缓慢，为生长迟滞期；3天后细胞生长加速，达到对数生长期；7～8天细胞数达最高值，为生长平台期，其后生长速度减缓。光镜下观察显示免疫细胞化学染色后的细胞膜抗原CD44有阳性表达。
讨 论
本组实验采用梯度密度离心法，操作简便，成本低。但MSCs体外培养时具有底物粘附性，造血细胞等因无法贴壁而
随换液被清除。结果显示，所培养细胞的干细胞P3、P5、P7三代细胞的生长曲线基本一致，培养时间基本同步，表明为同一干细胞的来源。因为所培养细胞的细胞膜抗原CD44阳性，而这些抗原是造血干细胞表面没有的，这说明培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞。综上所述，本组实验证实，我们所培养的细胞不是骨髓造血干/祖细胞和成纤维细胞，而是处于未分化阶段的均一的骨髓间充质干细胞，具有较强的遗传稳定性和增殖能力，可随冻随取，适于建立种子细胞库，是作为骨组织工程种子细胞的合适选择。
参考文献
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