基质金属蛋白酶对牙本质粘接耐久性的影响
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[摘要]基质金属蛋白酶（MMP）是一组分解细胞外基质的钙锌离子依赖型蛋白酶的总称。牙本质粘接剂酸性环境可以激活MMP酶原，进而分解暴露的胶原纤维，破坏粘接界面而导致粘接的失败。抑制MMP可有效增加粘接耐久性。本文就MMP在粘接过程中的激活和对粘接耐久性的影响以及MMP抑制剂的研究进展作一综述。
[关键词]基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制剂；乙醇湿粘接
[中图分类号]R 781.05[文献标识码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.04.022
Matrix metalloproteinases’influence on durability of dentin bondingWang Heng, Teng Wei.（Dept. of Prosthodontics, Hospital of Stomatology, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510055, China）
[Abstract]Matrix metalloproteinases（MMP）are a family of proteolytic enzymes with the main function of hydrolyzing extracellular matrix, of which activity requires calcium and zinc ions. The acidic component of dentin adhesives can activate the pro-MMP to degrade the nude collagen fibrils and destroy the interface of resin-dentin bond which leads to the failure of binding. Inhibiting MMP will increase bond durability. The purpose of this article is to review the research progress of MMP’s activating in resin-dentin bond and influence on bond durability, special attention being devoted to the means to inhibiting or inactivating MMP.
[Key words]matrix metalloproteinases；matrix metalloproteinases inhibitor；ethanol-wet bonding
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是一组依赖钙锌离子能够降解细胞基质外基质的蛋白酶。牙本质中MMP多由成牙本质细胞合成，并以蛋白酶原的形式分泌。研究[1]表明，牙本质中含有至少6种MMP：基质裂解素-1即MMP-3、胶原酶即MMP-8、明胶酶即MMP-2和MMP-9、MMP-14以及MMP-20，它们在牙本质形成、牙本质龋的发生发展等生理病理过程中发挥着重要作用。MMP一般由5个功能不同的结构域组成：疏水信号肽序列；前肽区；含锌离子结合位点的催化活性区；富含脯氨酸的铰链区以及与酶的底物特异性有关的凝乳酶样区。前肽区主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMP酶原才被激活[2]。
1粘接过程中MMP的激活
成熟矿化的牙本质中MMP多以酶原的形式存在，它的活化需要半胱氨酸转化的过程。酸性微环境可以改变前肽区的构象，诱导半胱氨酸转化，从而活化MMP[3]。
内源性MMP在粘接过程中可被酸性粘接剂激活。研究表明，全酸蚀和自酸蚀都能活化脱矿牙本质粉中的凝胶酶和胶原酶[4-5]。Nishitani等[4]利用自酸蚀粘接剂发现牙本质粉中MMP活性可增加14~15倍；但磷酸处理后酶活性反而下降，说明过低pH将可能导致酶失活。自酸蚀剂pH值通常在1~3左右，因此在使牙本质脱矿的同时不会失活MMP。而De Munck等[6]采用酶谱法研究得出了相反的结论，可能的原因是凝胶酶存在不同分子量片段，不同片段酶活性存在明显差异。
全酸蚀粘接剂本身并不能活化MMP酶原[7]。Mazzoni等[5]在使用全酸蚀剂处理牙本质时发现，磷酸处理后的牙本质MMP活性显著下降，但经过粘接剂处理后MMP活性又显著升高，且活性与粘接剂pH值成反比，可能是弱酸性的粘接剂可以活化失活后的MMP。
激活的MMP在酸性pH值下不能分解牙本质基质，依靠羟磷灰石的缓冲作用使pH值恢复中性后才能发挥其降解作用[3]。
2MMP降低粘接的耐久性
混合层的降解直接导致粘接力下降，缩短粘接寿命，即降低粘接的耐久性。Pashley等[8]将脱矿牙本质保存在无菌人工唾液中，250 d后牙本质几乎完全被降解破坏，首次证实了酸蚀后的牙本质可被内源性蛋白酶水解。目前研究表明纳米渗漏、水通路的形成可导致粘接树脂的洗脱，暴露原来被树脂包裹保护的胶原纤维，这类暴露后的胶原纤维极易被MMP降解[9]。水在降解过程中也扮演着重要的角色。“湿粘接”理论提出后，亲水性单体在粘接剂被大量使用。固化前后，其亲水性不会发生明显的改变，因此其带来的负面影响也就接踵而至。一方面，水是阻聚剂，它的存在使得粘接剂固化不全，至而影响粘接质量。另一方面，MMP的作用依赖于水的存在。研究者利用矿物油取代水来储存试件，结果显示随时间推移粘接强度未发生明显下降，提示水在MMP降低粘接耐久性中发挥重要作用[8]。De Munck等[6]认为，弱自酸蚀粘接剂不能活化MMP，因此其混合层降解机制可能与MMP酶解无关，而主要是水解作用。此外，水还可以破坏MMP抑制剂氯己定与胶原纤维的黏附作用[7]。
3抑制MMP增加粘接的耐久性
MMP组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP）是一类主要的内源性MMP抑制剂，正常生理情况下MMP与TIMP作用处于平衡状态，当各种病理过程导致细胞外基质缺乏保护时，则MMP起主要作用。使用外源性MMP抑制剂可以恢复MMP-TIMP平衡，提高粘接的长期稳定性[1]。
3.1MMP抑制剂
氯己定作为MMP非特异性抑制剂，已被众多体内外研究证实可以有效增加粘接的耐久性。其作用机制尚不明确，可能是氯己定与MMP竞争性螯合锌离子，缺乏阳离子的MMP不能被活化[1]。中性环境中氯己定显现正电荷，可与带有负电荷如磷酸盐、胶原中的羟羧基以及非胶原磷蛋白等产生静电引力，因此有利于氯己定在牙本质中的吸附。Carrilho等[10]采用2种浓度氯己定溶液（0.2%和2.0%）分别处理不同矿化程度的牙本质30 s后，储存在磷酸盐缓冲液中，测量不同时间段溶液的吸光光度值，发现所有脱矿牙本质中均保留大量的氯己定，且与储存时间无关，提示氯己定的作用效果具有持久性。Kim等[11]研究结果证实在使用较高浓度氯己定溶液时，氯己定的胍基与胶原纤维还可产生氢键作用。氯己定与胶原纤维黏附作用有利于初期氯己定在脱矿牙本质中的摄取，粘接剂固化后，氯己定便可被固定在相应的位置发挥作用。该研究还表明，脱矿牙本质摄取氯己定的量可是矿化牙本质9倍，除黏附力大小因素影响外，可能也与脱矿牙本质中MMP与胶原纤维的黏附为抑制剂提供了“粘接池”有关。被包埋在粘接剂中的氯己定可缓慢向外释放，与胶原纤维中游离氯己定一同形成储蓄池，当黏附胶原纤维的氯己定溶解析出后，可缓慢向外释放补充，延长其对MMP的抑制效果[12]。
另外，还有诸如加拉定等MMP-2、9特异性抑制剂。Breschi等[13]通过酶谱法证实，加拉定可以选择性抑制MMP-2、9，虽不能提高即时粘接效果，但可显著增加粘接的持久性。吡罗克酮乙醇胺、四环素、儿茶素没食酸酯等天然和人工合成的MMP抑制剂亦有报道，但能否应用与口腔还有待研究。
3.2蛋白交联剂
利用外源性蛋白交联剂使MMP肽链交联，失去分子动度后可使MMP丧失酶活性。蛋白交联剂如戊二醛、原花色素、碳化二亚胺可与脱矿暴露的牙本质胶原形成化学结合，有效提高脱矿牙本质的机械性能和树脂牙本质的粘接强度[14-15]。实验表明，浓度为1%的鞣酸即可抑制胶原酶的活性，酸蚀的牙本质经鞣酸处理后显现出良好的抗胶原酶水解能力，用树脂粘接后的微拉伸强度也较未经鞣酸处理的高[16]，提示利用交联剂可增加树脂牙本质粘接耐久性，但使用剂量、作用效果仍需要实验进一步研究。交联剂处理牙面时间较长，虽然有研究表明新型无毒性碳化二亚胺可将时间缩短至1 min[12]，但仍不便于临床应用。利用高浓度剂量或者各类抑制剂混合使用或许可以减少处理时间。
3.3螯合剂
MMP是阳离子依赖型酶，因此也有研究人员考虑使用阳离子螯合剂抑制MMP活性。Sauro等[17]用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）作为“酸试剂”处理牙体粘接面提高了粘接界面抗NaClO（非特异性脱蛋白剂）降解能力，提示EDTA可能提高粘接的耐久性。EDTA作为表面处理剂避免酸蚀剂所导致的胶原变性，改善混合层的质量，并且可余留较多的磷灰石保护胶原纤维；同时EDTA作为螯合剂可以抑制MMP的活性。但由于EDTA脱矿作用缓慢，牙表面处理需要数分钟，临床应用受到限制，因此可通过如螯合剂在牙面酸蚀后使用或适当降低螯合剂pH值等方法进行改进。
3.4乙醇湿粘接
提高粘接剂的疏水性可减少水带来的不利影响，因此也就成为近些年来研究的热点。MMP是水依赖型酶，水含量减少时可间接降低其活性。自酸蚀系统中水是不可或缺的，而在全酸蚀系统中引入乙醇湿粘接概念后，才使粘接剂中完全使用疏水单体成为可能。乙醇湿粘接与传统湿粘接相比，更有利于树脂单体渗入胶原网，形成更加稳定疏水的混合层结构，提高粘接强度的同时有效减少微渗漏和纳米渗漏的产生[18]。Sadek等[19]采用自制的疏水型粘接剂对牙本质进行乙醇湿粘接处理后经人工唾液老化1年，其微拉伸强度和纳米渗漏检测结果显示，提高粘接系统的疏水性可有效增加牙本质粘接的耐久性。有学者提出乙醇湿粘接中树脂单体可与胶原产生紧密接触，前者势必也可以与MMP的多肽发生类似的分子级别的联系，从而达到抑制MMP的效果[12]。或许这一观点可以为评估乙醇湿粘接的优势提供新思路。
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