水稻OsDCL3b基因组织表达分析和沉默载体的构建
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摘要：采用荧光定量ＰＣＲ方法分析了籼稻９３－１１根、茎、叶和花药中ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表达，发现水稻不同组织ＯｓＤＣＬ３ｂ的表达量存在明显差异，花药中表达量最多，根中表达量最少。重点构建了水稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默载体，通过农杆菌介导转化粳稻中花１１，获得了转基因Ｔ０代阳性植株，为进一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了基础。
关键词：ＯｓＤＣＬ３ｂ基因；组织表达；载体构建；基因沉默；水稻
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5788-03
Ｄｉｃｅｒ或Ｄｉｃｅｒ－ｌｉｋｅ（ＤＣＬ）蛋白通过产生ｓｉＲＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ＲＮＡ）和ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等小分子非编码ＲＮＡｓ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ，ｎｃＲＮＡｓ）［１］来调控其他相关基因的表达，进而影响真核生物的生长发育、抗病抗虫性和逆境适应性等［２－４］。
在水稻中，已报道至少存在８个可能的ＤＣＬ蛋白基因［５］。最初，Ｌｉｕ等［６，７］对ＯｓＤＣＬ１和ＯｓＤＣＬ４进行了功能分析，发现ＯｓＤＣＬ１与ｍｉＲＮＡ的生物形成密切相关，缺失ＯｓＤＣＬ１的生物个体在幼苗期出现发育停滞现象，如植株矮化、叶片卷曲、根扭曲等现象。ＯｓＤＣＬ４主要影响大小为２１ ｎｔ的ｓｉＲＮＡ的生物形成，与拟南芥同源基因ＡｔＤＣＬ４不同的是，沉默或缺失ＯｓＤＣＬ４既影响生物个体的营养生长，又影响生物个体的生殖生长，而ＡｔＤＣＬ４仅影响生物个体的营养生长。随后，Ｕｒａｙａｍａ等［８］的研究表明，敲除ＯｓＤＣＬ２的转基因植株中内源性ｄｓＲＮＡ病毒的含量水平将明显降低，植株表现为矮化和育性降低等。Ｗｕ等［９］证实，ＯｓＤＣＬ３ａ与ｌｍｉＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ）的产生密切相关。最近，Ｓｏｎｇ等［１０］进一步报道了ＯｓＤＣＬ４、ＯｓＤＣＬ３ｂ和ＯｓＤＣＬ１的功能；其中ＯｓＤＣＬ３ｂ的功能为首次报道，报道中仅指出了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物学功能是加工产生大小为２４ ｎｔ的小ＲＮＡ，但这些小ＲＮＡ究竟调控哪些相关功能基因的表达，以及相关功能基因的表达变化又如何影响转基因植株的生长发育、抗病抗虫性或逆境适应性等尚未见报道。基于在籼稻９３－１１花药中获得的ＯｓＤＣＬ３ｂ的全长ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＤＱ２０８４０６），采用荧光定量ＰＣＲ方法研究了籼稻９３－１１不同组织部位ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表达差异，并利用ＲＮＡ干扰技术构建了ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默载体，采用农杆菌介导法转化粳稻中花１１，获得了转基因Ｔ０代阳性植株，为进一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因加工产生的各种小分子ｎｃＲＮＡ究竟调控了哪些相关基因的表达、进而影响转基因植株的生长发育、抗病抗虫性或逆境适应性等打下了重要的基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料、菌种与质粒 籼稻９３－１１和遗传转化所用材料粳稻中花１１种子均由南昌大学生命科学与食品工程学院植物遗传研究室保存。用于基因沉默的质粒ｐＹＬ为改造的ＲＮＡｉ－Ｕｂｉ［１１］，由华南农业大学刘耀光教授惠赠。大肠杆菌Ｔop１０Ｆ′、农杆菌ＥＨＡ１０５由南昌大学生命科学与食品工程学院植物遗传研究室保存。
１．１．２ 主要试剂 ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＰＣＲ反应所用ＤＮＡ聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，植物ＲＮＡ提取试剂盒、反转录试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶ＢａｍＨⅠ、Ｈｉｎｄ Ⅲ、ＭｌｕⅠ和Ｐｓｔ Ⅰ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＰＣＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
１．２ 方法
１．２．１ 总ＲＮＡ的提取和正向干涉片段的ＲＴ－ＰＣＲ扩增 按Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＴＲＩｚｏｌ试剂盒提取籼稻９３－１１花药的总ＲＮＡ后，将其反转录成ｃＤＮＡ，再用引物ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｓｉ：５′－ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣ ＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧ－３′和ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｘｉ：５′－ＣＣＧＧＡＡＧ
２ 结果与分析
２．１ ＯｓＤＣＬ３ｂ在籼稻９３－１１根、茎、叶和花药中的表达结果
２．２ 沉默载体的构建结果
２．３ 转基因Ｔ０代阳性植株的鉴定结果
３ 讨论
前人的研究结果表明，粳稻ＯｓＤＣＬ３ｂ在营养组织中往往低水平表达，在花器官和种子发育初期则高水平表达［５］。本研究结果进一步显示，籼稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在籼稻９３-１１的花药中表达量最高，在其他组织中表达量均较低，尤其是在根中的表达量几乎只有花药中的５０％。由此推测，ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在水稻花药中高水平表达可能是水稻穗子的生长发育所必需的，但有待于进一步试验证实。
最近，Ｓｏｎｇ等［１０］首次报道了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物学功能是加工产生２４ ｎｔ的小ＲＮＡ，但是，这些小ＲＮＡ具体调控了哪些相关基因的表达，进而可能会导致转基因植株出现哪些差异表型等尚未见报道。研究获得的转基因Ｔ０代阳性植株为进一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了重要基础。
参考文献：
［１］ ＸＩＥ Ｚ，ＪＯＨＡＮＳＥＮ Ｌ Ｋ，ＧＵＳＴＦＳＯＮ Ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，２００４，２（５）：６４２－６５２．
［２］ ＢＥＲＮＳＴＥＩＮ Ｅ，ＣＡＵＤＹ Ａ，ＨＡＮＮＯＮ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａ ｂｉｄｅｎｔａｔｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９（６８１８）：３６３－３６５．
［３］ ＬＥＥ Ｙ Ｓ，ＮＡＫＡＨＡＲＡ Ｋ，ＰＨＹＡＭ Ｊ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｄｉｃｅｒ－１ ａｎｄ ｄｉｃｅｒ－２ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ，２００４，１１７（１）：６９－８１．
［４］ ＭＡＲＧＩＳＡ Ｒ，ＦＵＳＡＲＯＡ Ａ Ｆ，ＳＭＩＴＨＡ Ｎ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｃｅｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，２００６， ５８０（１０）：２４４２－２４５０．
［５］ ＫＡＰＯＯＲ Ｍ，ＡＲＯＲＡ Ｒ，ＬＡＭＡ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｃｅｒ－ｌｉｋｅ，Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ａｎｄ ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ pｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ［Ｊ］． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，９（１）：４５１．
［６］ ＬＩＵ Ｂ，ＬＩ Ｐ Ｃ，ＬＩ Ｘ，ｅｔ ａｌ． Ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＯｓＤＣＬ１ ａｆｆｅｃｔｓ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５，１３９（１）：２９６－３０５．
［７］ ＬＩＵ Ｂ，ＣＨＥＮ Ｚ Ｙ，ＳＯＮＧ Ｘ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｄｉｃｅｒ－ｌｉｋｅ４ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００７，１９（９）：２７０５－２７１８．
［８］ ＵＲＡＹＡＭＡ Ｓ，ＭＯＲＩＹＡＭＡ Ｈ，ＡＯＫＩ Ｎ，ｅｔ ａｌ． Ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ ｏｆ ＯｓＤＣＬ２ ｉｎ ｒｉｃｅ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｄｓＲＮＡ ｖｉｒｕｓ， Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｅｎｄｏｒｎａｖｉｒｕｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１０，５１（１）：５８－６７．
［９］ ＷＵ Ｌ，ＺＨＯＵ Ｈ，ＺＨＡＮＧ Ｑ，ｅｔ ａｌ． ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１０，３８（３）：４６５－４７５．
［１０］ ＳＯＮＧ Ｘ，ＬＩ Ｐ，ＺＨＡＩ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＤＣＬ４ ａｎｄ ＤＣＬ３ｂ ｉｎ ｒｉｃｅ ｐｈａｓｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２０１１，６９（３）：４６２－４７４．
［１１］ 胡旭霞，刘耀光．植物ＲＮＡ干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用［Ｊ］．分子植物育种，２００６，４（５）：６２１－６２６．
［１２］ 韦靖鸾，陈 深，曾列先，等．水稻白叶枯病抗性基因Ｘａ７候选基因的实时荧光定量表达分析［Ｊ］．分子植物育种，２０１１，９（１）：９－１６．