结核菌分离培养方法对照与分析

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【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2010)03 - 131 - 02

结核病是人类最古老但至今仍不能控制的疾病,其病程长.病死率高,而结核菌分裂周期长,生长繁殖缓慢.给临床诊断和治疗带来许多困难。因此结核工作者高度关注和重视结核菌的培养。本文使用传统罗氏培养法与BacT ALERT3D培养系统进行对照试验,现将结果分析报告如下。

1 酸性改良罗氏培养基成分及其制备

1.1 酸性改良罗氏培养基成分

KH2PO4 4.0g

MgSO4 0.4g

柠檬酸镁 1.0g

谷氨酸钠 6.0g

甘油 20ml

马铃薯粉 30g

2% 孔雀石绿 20ml

全卵液 1000ml

蒸馏水 600ml

1.2 制作方法(1)基础液制备:量取蒸馏水600ml,加入无机盐成分,谷氨酸钠和甘油溶解后加入马铃薯粉,混匀,沸水浴1h(不时搅拌),冷却。(2)新鲜鸡蛋卵液制备:用75%乙醇将鸡蛋的壳拭净(10个鸡蛋约500g)以无菌操作将鸡蛋打入一个灭菌的三角烧瓶中,用预先高压的玻璃棒打碎鸡蛋,搅匀,通过消毒的纱布过滤成卵液。(3)分装:将600ml基础液和1000ml新鲜鸡蛋卵液混匀,加入2% 孔雀石绿20ml,混匀,静置1 h。在无菌条件下,分装到灭菌的螺口试管中,(8ml/管)。(4)灭菌:将试管盖略旋松,85℃,1 h,蒸汽灭菌(试管倾斜)。置37℃培养24 h,使芽孢复性;重复该步一次后,将余下的芽孢杀灭,旋紧管口。

1.3 储存4℃保存备用。

1.4 BacT ALERT3D培养基美国BD公司生产。

1.5 痰液标本前处理、接种、结果观察取我院临床确诊患者痰标本。采用半胱氨酸一氢氧化钠法前处理(半胱氨酸临用时配制)。处理好的痰液依次加入2支酸性罗氏培养基各0.1 m1加入BacT ALERT3D(预先以75%酒精消毒瓶口,待自然风干后,加入0.25ml抗生素补充剂)0.5ml。BacTALERT3D培养管置仪器养,除非阳性(涂片、抗酸染色确认),阴性标本42 d报告结果。酸性罗氏斜面培养基平卧放置37℃培养箱24 h.然后直立放置,接种后3、7 d各观察1次.看有无细菌生长及杂菌污染,继续培养直至生长出肉眼可见的结核菌苗落、涂片、抗酸染色确认,同时接种标准菌株H37Rv做阳性对照。

1.6 统计学处理阳性率比较采用r检验,敏感性、特异性用诊断性试验四格表计算法。

2 结 果

2.1 分离培养结果100例临床标本中罗氏分离出结核菌40例,阳性率40%。与国内报道一致[1]。3D分离出结核苗38例,阳性率38%。其中罗氏培养阳性3例中3D培养阴性2例.另1例经延长1周后3D转为阳性。

2.2 平均阳性报告时间罗氏培养时间11～52 d。平均阳性报告时间22.2 d; 3D培养系统培养时间7～49 d(1例是在第49天培养瓶底颜色变黄后.经涂片确认为阳性的)。平均阳性报告时间16.9 d。

2.3 污染率罗氏培养基单管污染3例,两管和3D同时污染1例, 3D单独污染3例。罗氏污染率(包括单管)为3.0%,污染菌多为真菌,偶见革兰阴性杆菌。3D培养系统污染率4.0%,污染菌以革兰阴性杆菌、葡萄球菌为主。

2.4 两周内阳性率酸性改良罗氏15.2%,ALERT3D机器55.8%。3周内阳性率分别为:56.8%、70.8%。4周内阳性率分别为:78.8%、90.3%。5周内阳性率分别为93.9%、93.8%。从阳性报告的阳性率可以看出在第2周和第4周时间段.3D机器培养法分别为55.8%和90.3%.高出酸性改良罗氏法,酸性改良罗氏与机器法比较阳性率差异有统计学意义(PO.05)。

3 讨 论

从结果可以看出,2种方法培养的阳性率无显著性差异, 但在所需的培养时间上有显著性差异,在临床治疗中就有非常大的指导意义,可以及时了解病人的病情,改变治疗方案,对病人的治疗和预后都起到巨大的意义。培养阴性原因分析:(1)可能标本中分支杆菌的数量少。(2)抗结核药物使用后.使结核菌分裂繁殖减慢。(3)抗结核药物以厦其他药物抑制了结核菌的生长。(4)标本在前处理过程中,消化液浓度过高,过分损伤了结核菌。(5)前处理时问掌握不当,杀灭杂菌的同时也过量损伤了结核菌。(6)培养基灭菌效果不佳或培养过程中有杂菌污染等原因也可影响结核菌的生长。

【参考文献】

[1] 王成勇,赵洪发,周峰.结核分支杆菌两种培养方法的对照临床.肺科杂志,2004,9(1):97.