光谱法结合分子模拟表征脱氧土大黄苷与血清白蛋白的分子作用机制
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[摘要] 目的：研究中药活性成分脱氧土大黄苷（desoxyrhaponticin，DES）与人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的分子作用机制。方法：模拟生理条件下，计算机模拟技术结合荧光光谱法和紫外光谱研究药物与蛋白质的结合机制。结果：分子模拟建立DES与HSA的结合模型，表明维持药物与蛋白质的相互作用力主要是疏水作用力，兼有氢键作用。光谱实验表明DES与HSA的相互作用表现为动态结合过程，结合强度较强，DES与HSA分子的结合距离r值较小，说明发生了能量转移现象。DES对HSA的结构域微区构象产生影响，使结合位域的疏水性发生改变。荧光相图技术解析出DES与HSA反应构象型态的变迁为“二态”模型。HSA与DES互作的热力学参数表明DES与HSA之间是以疏水作用为主的分子间作用。荧光偏振定量证明了HSA与DES相互作用过程中生成了非共价复合物。结论：光谱实验与计算机模拟结果一致，可为研究DES与HSA相互作用本质提供一定参考。
[关键词]脱氧土大黄苷；人血清白蛋白；光谱实验；分子模拟
血清白蛋白具有贮运内源代谢产物和外源药物分子等重要生理功能[1]。血清白蛋白相对分子质量较小，溶解性较大、稳定性较好、与配体具有较好的亲和性，易于分离、提纯且其三级结构已知，是理想的模型蛋白质分子。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）[2]为585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其氨基酸全序列含有35个半胱氨酸残基，形成17对二硫键和一个自由的半胱氨酸残基，二硫键中有8对组成交叉二硫键，只有接近N端的是单个二硫键。HSA含有18个酪氨酸残基，在214位上含有一个色氨酸残基，N端为天冬氨酸残基，C端为亮氨酸残基。分析生理条件下药物与HSA的相互作用可以获得药物的药效学信息，深入阐明药物输送机制，也有助于为药物分析提供理论参考，此是具有意义的工作。
脱氧土大黄苷（desoxyrhaponticin，DES），分子式为C21H24O8，是天山大黄的有效成分之一，具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、调节机体免疫系统、抗血栓和抗氧化等作用[3]。当前，脱氧土大黄苷与人血清白蛋白的相互作用研究未见文献报道。本文基于光谱法结合分子模拟技术研究了DES结合HSA的相互作用，获得了结合反应常数、热力学函数等并考察了药物对蛋白质构象的影响，从分子水平上阐释DES与HSA的相互作用机制。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 人血清白蛋白（HSA， ≥98%）、脱氧土大黄苷（DES， ≥98%）、三羟甲基氨基甲烷 （Tris， GR）均购于上海华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为亚沸蒸馏去离子水。配制浓度为0.1 mol・L-1，pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液（内含0.10 mol・L-1NaCl维持离子强度），用此缓冲溶液配制1.0×10-5 mol・L-1的HSA，乙醇溶液配制1.0×10-3 mol・L-1 DES溶液。
F-4500型荧光光度计（日本Hitachi公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；ZD-2型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；SGI O2计算机图形工作站，DOCK软件（4.02版本）。
1.2 分子模拟 利用SGI O2工作站上的DOCK 4.02程序包建立药物与蛋白质相互作用模型，进行分子模拟计算。HSA晶体结构的PDB代码：1h9z。ChemDraw工具构建DES分子结构，然后基于分子力学MM2力场优化后生成实验分子模型，分子对接预处理时使用AutoDock Toolkit（ADT）进行受体与配体的优化处理。分子对接技术确认HSA活性部位，选择配体为中心的10范围为对接的活性中心。确定活性部位步骤：①确定DES结合活性位点；②在配体结合位点填充球簇以映射受体结合腔穴的性质；③尝试匹配不同小球中心的距离和配体中不同原子的距离，进行配体在受体活性位点处的构象搜索；④以经验势能函数作为评价函数，找到配体与受体的最佳结合方式[4]。程序的打分函数选择程序默认的输入和退火参数。针对建立的HSA-DES分子对接体系进行re-dock验证，去除DES后重新对接生成新的HSA-RWF（R-warfine）分子对接体系并比对PDB库数据中原对接体系以确证可靠性。
1.3 方法 HSA与DES溶液的荧光光谱及DES溶液的吸收光谱测定：移取2.5 mL HSA溶液于1 cm石英比色皿中，微量进样器逐次加入1.0×10-3 mol・L-1DES溶液进行荧光滴定（滴定剂累加体积≤100 μL），缓冲溶液做荧光空白校正，荧光发射与激发狭缝宽度均为2.5 nm，波长扫速1 200 nm・min-1，固定激发波长282 nm，室温下绘制250～900 nm的发射谱；荧光光谱仪扫描激发波长和发射波长之间的波长差分别为Δλ 15 nm和Δλ 60 nm上述溶液体系的同步荧光光谱。发射与激发狭缝宽度同上，扫速240 nm・min-1，Tris-HCl缓冲溶液做荧光空白校正。移取2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液于1 cm石英比色皿中，微量进样器加入1.0×10-3 mol・L-1 DES溶液，使其浓度为1.0×10-5 mol・L-1，测定500～190 nm紫外吸收光谱，中速扫描，狭缝宽度2.5 nm，缓冲溶液定基线。
1.4 理论基础 蛋白质-药物相互作用的荧光猝灭机制：蛋白质-药物相互作用的动态荧光猝灭过程遵循Stern-Volmer方程[5]。
F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D]（1）
式中：Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命，[D]为猝灭剂（DES）的浓度，Ksv为Stern-Volmer猝灭常数。
蛋白质-药物相互作用的理论方程：药物-蛋白质相互作用采用方程（2）获得相应的结合参数[6]。
lg[（F0-F）/F]=lgK+nlg[Df]（2）
F0与F分别为猝灭剂加入前后荧光分子的相对强度，K是结合常数，n是结合位点数，[Df]为猝灭剂的游离浓度。
Fōrster非辐射能量转移理论：Fōrster非辐射能量转移理论[7]求算药物-蛋白质能量转移效率E，结合距离r及临界能量转移距离R0方程如下。
E=R06/（R06+r6）（3）
E为能量转移效率；R0为能量转移效率E为50%时的临界能量距离。
R06=8.8×10-25K2N-4ΦJ（4）
式中：K2为偶极空间取向因子；N为介质的折射指数；Φ为蛋白质分子的光量子效率；J为蛋白质分子荧光发射光谱与药物吸收光谱间的光谱重叠积分。
2 结果与讨论
2.1 分子模拟结果 分子对接模拟计算时，考虑HSA的Sudlow′s sites I，sites II[9]，6个脂肪酸结合位点及warfarin结合位点进行DES分子对接的模拟计算，分子对接通过参数的对比来寻找药物分子的最优结合位点与模式。分子对接DES与HSA的结合模型见图1 （显示配体周围10.0范围内的氨基酸残基）。DES分子结合在HSA的表面活性口袋处，整个分子处于被包围状态。DES分子距HSA色氨酸残基（Trp214）及苯丙氨酸残基（Phe206，Phe211，Phe330）很近，这很好解释了DES能够猝灭HSA内源荧光的现象。同时，DES分子与HSA结合过程中，DES分子中苯环上羟基的氧原子与Leu481发生氢键相互作用，且DES环氧环上23号位和25号位羟基的氧原子分别与Lys199，Ser202发生氢键相互作用；另一方面，DES非共价结合在HSA活性位点域，其结合口袋周围主要由Leu198，Leu203，Leu327，Leu331，Leu347，Leu349，Leu481，Ala201，Ala210，Ala213，Ala215，Phe206，Phe211，Phe330，Trp214，Val343，Val344，Val482氨基酸残基形成一个疏水区域，可以清楚观察到DES结合位点处的疏水相互作用，即疏水作用在DES-HSA复合物形成中起重要作用，疏水作用是药物和蛋白质分子结合的主要驱动力。分子模拟结果进行re-dock验证，发现AutoDock对此体系可靠。
由分子模拟结果可知DES与HSA的主要作用力为疏水作用力，兼有氢键的存在，为验证DES与HSA的键合机制和键合方式，通过光谱实验进一步证实分子模拟的合理性。
2.2 HSA与DES相互作用的荧光光谱及结合反应机制 HAS，DES及二者以等物质的量混合体系的荧光光谱见图2。在282 nm激发波长下，DES的最大发射波长为 393 nm左右，HSA最大发射波长为339 nm，而由DES-HSA体系的荧光光谱可以看出，药物的加入使HSA的荧光强度降低，表明药物与HSA之间存在着相互作用，发生了能量转移。
DES-HSA的紫外吸收差谱见图3，可以发现HSA的紫外吸收曲线及DES-HSA等摩尔混合物与DES的差谱几乎完全重合，表明DES的加入并未使HSA的紫外吸收发生变化，可以初步确定DES与HSA分子的荧光猝灭机制为动态猝灭。同时由图3可见，DES在282 nm激发波长及339 nm发射波长下没有吸收，因此，可不考虑内滤光效应。
分析图4可知，a峰为HSA的一级荧光峰，可以看出随着药物的加入，a峰逐渐降低；b峰为DES的一级荧光发射峰；c峰为激发峰的二级倍频荧光峰；d峰为HSA的二级倍频荧光峰。固定HSA浓度，随着药物浓度增大，HSA的荧光强度呈规律性的降低，这表明药物对血清白蛋白有猝灭作用。荧光最大发射峰位置出现20 nm的红移（A，B两图均如此），说明DES和HSA确实存在相互作用，造成HSA分子中与DES相互作用的氨基酸残基的微区环境发生一定变化。
为确定药物对蛋白质荧光的猝灭机制，由实验测得DES与HSA相互作用的荧光光谱数据，按方程（1）处理可得图5。
由于无猝灭剂时生物大分子的平均荧光寿命τ0=1×10-8 s[10]，则由实验数据可以通过Stern-Volmer方程计算不同温度下DES-HSA相互作用的猝灭常数Ksv，Kq，计算结果见表1。
目前生物大分子与活性小分子相互作用研究中，常用2种方法判定荧光猝灭机制，一种方法是比较双分子猝灭过程速率常数与猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭速率常数来间接判断[11]；另一种方法是通过变温实验直接推断[12]。本实验为确定DES对HSA的猝灭机制，在不同温度下作DES对HSA荧光猝灭的Stern-Volmer图见图5。从图5可见，在选定的浓度范围内，随着温度升高，猝灭常数呈增大趋势，初步表明DES对HSA的猝灭机制为动态猝灭。另外，判断静态猝灭和动态猝灭的另一个方法是考察荧光物质的吸收光谱。静态猝灭中，基态配合物的形成会引起荧光物质的吸收光谱不断变化，而动态猝灭仅仅影响荧光物质的激发态，不影响荧光物质的吸收光谱，据此可判断该体系是否属于动态猝灭[13]。考察DES-HSA体系的吸收光谱（图3），发现HSA的紫外吸收谱和DES-HSA混合物的紫外吸收谱与DES紫外吸收差谱几乎完全重合，表明药物的加入并未使HSA的紫外吸收发生变化，由此2个结果可以确定DES与HSA的荧光猝灭机制为动态猝灭。
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Molecular action mechanism of desoxyrhaponticin and serum albumin
characterized by spectroscopy combined with molecular modelling
GUO Ming*， FAN Wen-xiang， HU Run-huai
（School of Science， Zhejiang Agriculture & Forestry University， Lin′an 311300， China）
[Abstract] Objective： To study the molecular action mechanism of active constituents desoxyrhaponticin （DES） and human serum albumin （HSA）. Method： Under the simulated physiological condition， computer analog technology， fluorescent spectrometry and ultraviolet spectrum were combined to study the binding mechanism between drug and protein. Result： Molecular modeling was adopted to establish the binding model between DES and HSA， suggesting that the interaction force maintaining drug and protein is mainly the hydrophobic interaction with a hydrogen-bond interaction. The results from spectroscopy indicated that the interaction between DES and HSA is a dynamic binding process with a high intensity. The value of the binding distance （r） between DES and HSA was low， which demonstrate the occurrence of energy transfer. DES made an impact on HSA′ structural domain microcell conformation， which resulted in hydrophobic changes in binding areas. According to the fluorescent phase diagram technical analysis， the changes in the DES-HSA reaction conformational pattern showed a "two-state" model. According to the obtained thermodynamic parameters for the DES-HSA interaction， the interactional force between DES and HSA was mainly a hydrophobic interaction. The fluorescence polarization proved that a non-covalent compound was generated during the interaction between DES and HSA. Conclusion： The spectrum experiment showed consistent results with the computer analog technology， which could provided certain reference for studies on the interaction between DES and HSA.
[Key words] desoxyrhaponticin； human serum albumin； spectrum experiment； molecular modeling
doi：10.4268/cjcmm20140624